摘 要： 建立了液相色譜串聯質譜快速測定液態發酵食品中曲酸含量的測定方法。樣品經酸化乙腈提取，十八烷基鍵合硅膠吸附劑（C18）凈化后，在Shim-pack GIST-HP C18-AQ液相色譜柱（2.1 mm×100 mm，1.9 µm）上使用乙腈和0.1%甲酸溶液-5 mmol/L甲酸銨溶液進行梯度洗脫，電噴霧正離子（ESI+）模式下檢測目標物曲酸，內標法定量。在最佳實驗條件下，曲酸實現良好的分離，在3～200 ng /mL范圍內有良好的線性關系，相關系數為0.999 0，方法的檢出限為1 μg/kg。在低、中、高三個不同濃度水平的加標回收率為85.88%～101.72%，測定結果的相對標準偏差為2.45%～9.38%（n=6）。該方法可為液態發酵食品中曲酸的日常含量監測提供技術支持。

關鍵詞： 液相色譜串聯質譜法； 曲酸； 液態發酵食品

 

曲酸（5-羥基-2-羥甲基-1,4-吡喃酮）是氧化狀態下通過發酵產生的有機酸，一般為微黃色或無色晶體，易溶于水、丙酮，難溶于石油醚和苯，對光和熱敏感[1?2]。曲酸作為曲霉屬和青霉屬真菌產生的代謝產物，添加到食物中不影響食物的口感和質感，且作為食品添加劑有著較好的防腐、保鮮和抗氧化作用，因此在傳統釀造食品中被廣泛使用[3?4]。但是曲酸的安全性一直備受爭議，2017年世界衛生組織（WHO）國際癌癥研究機構宣布將曲酸列為三類致癌物[5]。液態發酵食品作為傳統釀造食品的一個分支，其曲酸含量水平也成為了大眾關注的風險隱患。因此開展液態發酵食品中曲酸的監測對保障人體健康具有重要的意義。

曲酸的檢測方法主要有薄層色譜法[6]、氣相色譜法[7?8]、紅外光譜法[9]、高效液相色譜法[10?11]。其中薄層色譜法和分光光度法人為因素誤差大，操作繁瑣且不能準確定性；氣相色譜法衍生后才能測定，干擾大，對樣品預處理的要求也高[10]；液相色譜法具有良好的選擇性，但是測定檢出限較高，對于微量成分難以實現準確定量。近年來，一種新型的色譜技術-液相色譜-串聯質譜(LC-MS/MS)被廣范應用，它具有高靈敏度，高選擇性和較寬的線性范圍。應用液相色譜串聯質譜技術檢測曲酸涉及的標準有SN/T 3835—2014 《出口食品中曲酸的測定　液相色譜-質譜/質譜法》。由于液態發酵食品大多通過高粱、大米等谷物經細菌發酵而來，成分復雜[12]，單純采用乙酸鋅和亞鐵氰化鉀作為沉淀劑，沉淀過程可能會導致曲酸損失，沉淀后過膜直接測定無法有效去除大部分雜質，進入色譜系統后，容易堵塞色譜柱，污染質譜端，對實驗結果造成干擾，且檢出限高。陳東洋等[13]采用固相萃取法對樣品進行前處理，雖能有效的去除雜質干擾，但步驟繁瑣、操作復雜且大批量檢測時萃取小柱使用量較大，檢測成本高。基于QuEChERS原則對樣品進行預處理，再結合液相色譜串聯質譜技術，筆者建立了一種凈化效果好、高效、高靈敏度、高回收率且低成本的液態發酵食品中曲酸的測定方法，適合大批量樣品的快速檢測，為液態發酵食品中曲酸的風險評估提供數據支持。

 

1. 實驗部分

 

1.1 主要儀器與試劑

液相色譜-質譜聯用儀：LCMS-8060型，日本島津公司。

高速冷凍離心機：HC-3018R型，安徽中科中佳科學儀器有限公司。

樣品渦旋混合器：MultiVortex型，廣州得泰儀器科技有限公司。

電子天平：SQP型，感量為 0.1 mg，賽多利斯科學儀器（北京）有限公司。

超純水機：Milli-Q型，德國默克公司。

氮吹儀：Auto NE-24basic型，深圳新銳精儀科技有限公司。

曲酸標準溶液、內標U-[13C6]-曲酸溶液：質量濃度分別為1 000、50 μg/mL，青島普瑞邦生物工程有限公司。

甲酸：色譜純，上海安普實驗科技股份有限公司。

乙腈、甲酸銨：色譜純，德國默克公司。

氯化鈉、無水硫酸鈉：分析純，天津市大茂化學試劑廠。

十八烷基鍵合硅膠（C18）：美國安捷倫科技公司。

實驗用水為經Milli-Q凈化系統過濾的超純水。

1.2 儀器工作條件

1.2.1 色譜條件

色譜柱：Shim-pack GIST-HP C18-AQ液相色譜柱（100 mm×2.1 mm，1.9 μm，日本島津公司）；流動相：A為乙腈，B為0.1%甲酸溶液-5 mmoL/L甲酸銨溶液；梯度洗脫程序：0~1 min，1%A；1~1.5 min，1%~10%A；1.5~3 min，10%A；3~3.5 min，10%~90%A；3.5~4 min，90%A；4~4.1 min，90%~1%A；4.1~10 min，1%A；流量：0.3 mL/min；柱溫：40 ℃；進樣體積：2 μL。

1.2.2 質譜條件

離子源：電噴霧離子源（ESI）；掃描方式：正離子掃描模式；監測方式：MRM模式；霧化氣流量：3 L/min；加熱氣流量：10 L/min；接口溫度：300 ℃；接口電壓：1 000 V；DL溫度：250 ℃；加熱塊溫度：400 ℃；曲酸及內標優化的質譜參數見表1。

表1   曲酸及內標優化的質譜參數

Tab. 1   MS parameters for the analysis of kojic acid and internal standard

注：*表示定量離子。

 

1.3 曲酸系列標準工作溶液的配制

準確移取0.1 mL曲酸標準溶液于10 mL容量瓶中，用水稀釋成質量濃度為10 μg/mL的標準中間液。準確移取0.2 mL U-[13C6]-曲酸溶液至10 mL容量瓶中，用乙腈稀釋成1 μg/mL 的內標中間液。

吸取不同體積曲酸標準中間液，用初始流動相稀釋配制系列標準工作溶液，配制質量濃度分別為3、5、10、20、50、100、200 ng/mL，其中內標的質量濃度均為20 ng/mL。

1.4 樣品預處理

稱取2 g樣品于50 mL離心管中，加40 μL內標中間液，再加10 mL乙腈渦旋5 min，超聲提取5 min后，加入1 g氯化鈉和3 g無水硫酸鈉，立即劇烈渦旋1 min，以8 000 r/min離心5 min，取上清液，備用。取上清液5 mL于15 mL離心管中，加入100 mg無水硫酸鈉和100 mg C18粉末，渦旋1 min后，以8 000 r/min離心5 min，取全部上清液于40 ℃下氮氣吹至近干，1 mL初始流動相復溶、過膜后上機測定。

1.5 樣品測定

按照1.2儀器工作條件設定參數，將系列標準工作溶液及處理后的樣品溶液注入高效液相色譜-串聯質譜儀，以曲酸色譜峰與相對應內標色譜峰的峰面積比值-質量濃度為橫坐標作圖，得到內標法-標準曲線回歸方程并對樣品中的曲酸含量進行計算。

 

2. 結果與討論

 

2.1 質譜條件優化

配制1 μg/mL的曲酸和U-[13C6]-曲酸標準溶液，在不接色譜柱的條件下，分別采用正離子模式（ESI+）和負離子模式（ESI-）對母離子進行掃描，二者的[M+H]+響應信號均高于 [M+H]-峰，綜合考慮選用ESI+模式。利用島津的三重四級桿質譜軟件，對目標化合物的子離子、Q1 Pre偏差電壓、Q3 Pre偏差電壓以及碰撞能量（CE）等參數進行優化，優化結果見表1。

2.2 色譜條件的優化

2.2.1 色譜柱的優化

曲酸的Log P為-0.64，屬于強極性的化合物，因此選擇對曲酸具有強保留的反相色譜柱至關重要。分別考察Shim-pack XR-ODS Ⅲ色譜柱（75 mm×2.0 mm，1.6 μm）、ACQUITY UPLC HSS T3（100 mm×2.1 mm，1.8 μm）、ACQUITY UPLC BEH C18 （100 mm×2.1 mm，1.7 μm）和 Shim-pack GIST-HP C18-AQ（100 mm×2.1 mm，1.9 μm）4種柱子對曲酸的分離效果。結果表明，4種色譜柱均對曲酸有良好的保留，但前兩種色譜柱存在嚴重的峰展寬現象，且色譜峰的峰型對稱性較差；后兩種色譜柱的出峰時間均在2～3 min。在同等條件下，Shim-pack GIST-HP C18-AQ響應信號是ACQUITY UPLC BEH C18響應信號的1.5倍，因此最終選擇Shim-pack GIST-HP C18-AQ作為分析柱。

2.2.2 流動相的優化

曲酸作為二元有機弱酸，向流動相中加甲酸可提高溶液的酸度，使得曲酸以游離的分子形式存在，將色譜柱殘余硅羥基降至極限，避免色譜拖尾現象，獲得較好的色譜峰型。考察了0.1%甲酸水與乙腈、甲醇分別作為流動相時對曲酸的分離效果。結果表明，乙腈作為有機相時，峰型和分離度與甲醇無明顯差異，但出峰時間相對較早，洗脫能力強且儀器系統壓力較低。同時優化了不同酸度（0.5‰、0.1%、0.5%甲酸、1%甲酸），試驗結果表明在0.1%甲酸條件下曲酸的靈敏度更高。加入甲酸銨可提高曲酸的離子化效率，峰型更加尖銳對稱，基線噪聲降低，因此最終選擇5 mmoL/L甲酸銨（0.1%甲酸溶液）和乙腈作為梯度洗脫溶劑。采用Shim-pack GIST-HP C18-AQ柱對曲酸及其內標進行檢測。

 

2.3 樣品預處理條件的優化

2.3.1 提取溶劑的優化

樣品的提取和凈化是樣品制備的關鍵步驟。提取溶劑的選擇在目標化合物的提取過程中起著重要作用。曲酸是極性弱酸，在水或強親水性有機溶劑（甲醇、乙腈）中溶解度很高[13?14]。分別用10 mL甲醇、乙腈、0.1%甲酸乙腈、0.5%甲酸乙腈、1%甲酸乙腈作為提取溶劑經10 min超聲提取目標化合物，不同溶劑提取下曲酸的回收率見圖2。由圖2可知，在10 μg/kg添加水平下（n=3），5種溶劑的平均回收率72.0%～90.4%，乙腈作為提取溶劑時平均回收率優于甲醇，且加入一定量甲酸后回收率得到提升，通過試驗數據發現0.1%甲酸乙腈可作為最優提取溶劑。

圖2   不同溶劑提取下曲酸的回收率

Fig. 2   Recoveries of kojic acid using different extraction solvents

提取溶劑 ；1—甲酸； ；2—乙腈；3—0.1%甲酸乙腈；4—0.5%甲酸乙腈；5—1%甲酸乙腈

 

2.3.2 提取方式的優化

對比不同的提取方式（渦旋、超聲、振搖、渦旋+超聲、渦旋+振搖）對曲酸的提取效果的影響，不同提取方式下曲酸的回收率見圖3。由圖3可知，振搖的提取效果最差，渦旋、超聲和渦旋+振搖3種提取方式下曲酸的回收率均在86.4%～89.6%范圍內，無明顯差異，而渦旋結合超聲振搖的提取效率達到90%以上，能夠更好地滿足實驗需求，因此選擇渦旋5 min再超聲5 min的提取方式。

圖3   不同提取方式下曲酸的回收率

Fig. 3   Recoveries of kojic acid under different extraction methods

提取方式 ；1—渦旋； ；2—超聲；3—振搖；4—渦旋+超聲；5—渦旋+振搖

 

2.3.3 除水劑的優化

無水硫酸鎂和無水硫酸鈉是常用的除水劑。試驗比較了不加除水劑，直接用乙腈萃取，回收率不到40%，原因是大部分曲酸仍溶解在水中，未被乙腈萃取。對比了兩種無水硫酸鹽的除水效果，結果表明前處理加入無水硫酸鎂后，樣品表明會形成堅硬的外殼，導致提取效果明顯下降，因此選擇了相對溫和的無水硫酸鈉作為除水劑。此外，在樣品中加入氯化鈉起到鹽析和降低曲酸和乙腈在水中的溶解度作用，后加入無水硫酸鈉除去乙腈層中的水分，與鹽析作用相配合，使乙腈對曲酸的萃取回收率達到90%以上。不同組合的無水硫酸鈉和氯化鈉條件下曲酸的回收率見表2。由表2可知，10 mL的萃取劑提取后，加3 g無水硫酸鈉和1 g氯化鈉時回收率最高。因此選擇3 g無水硫酸鈉和1 g氯化鈉作為最佳使用量。

表2   不同組合的無水硫酸鈉和氯化鈉條件下曲酸的回收率

Tab. 2   Recovery rate of quercetin under different combinations of anhydrous sodium sulfate and sodium chloride conditions

 

2.3.4 凈化劑的優化

QuEChERS預處理技術中常用的凈化劑種類包括PSA、C18粉、GCB等[15?16]。PSA是在硅膠上鍵合了N-丙基乙二胺官能團的吸附劑，可吸附酸性化合物[17]；C18粉是在硅膠上鍵合了十八烷基填料的吸附劑，具有比表面積大，吸附能力強等優點，可去除脂類、膽固醇和親酯化合物等非極性干擾物[18]；GCB是具有片層結構的弱極性吸附劑，能夠有效去除色素。

考察不同吸附劑對曲酸的吸附效果，以超純水配制的20 ng/mL標準溶液為分析對象，吸附劑PSA、C18粉和GCB用量均為100 mg時，結果發現PSA和GCB對曲酸的吸附率達到60%以上，主要由于曲酸是一種平面結構的有機弱酸，因此選擇C18粉凈化樣品。

以醋樣為基質，通過100 mg 無水硫酸鈉進一步除水后，在10 μg/kg的加標水平下，考察了不同用量的C18粉（50、100、150、200 mg）對樣品溶液凈化效果和回收率的影響。結果顯示，隨著不斷增加C18粉的用量，目標物曲酸的回收率呈先上升后下降的趨勢，C18粉用量為100 mg時，凈化效果和回收率最佳，因此選擇100 mg C18粉吸附劑進行凈化。

2.4 基質效應評價

基質效應主要是樣品中待測物和待測物以外的干擾物，在霧滴表面離子化的過程中產生競爭，影響電噴霧接口處的離子化效率，產生不同程度的待測物物響應信號的抑制或增強，同時可能干擾待測物的出峰位置。基質效應的計算公式為ME=(空白樣品基質中標準物質的響應值/純溶劑中標準物質得到的響應值-1)×100%。通常ME< ±20%為弱基質效應；±50% < ME < ±20%為中等基質效應；ME < -50% 或 > +50%則為強基質效應[19]。對比不同基質的空白樣品在未凈化和經QuEChERS凈化后樣品對曲酸響應值的影響，并分別進行了三個濃度（低、中、高）的考察，不同基質中曲酸的基質效應見圖4。

圖4   不同基質中曲酸的基質效應

Fig. 4   Matrix effects of kojic acid in different substrates

由圖4可知，未凈化的樣品基質效應ME為-12.6%～-55.2%，凈化后的ME為-5.6%～-32.8%，凈化后的基質抑制明顯改善，且隨著待測物濃度的提高基質效應顯著。酒的ME為-5.6%～-9%，食醋的ME為-10.2%～-15.6%，二者均表現為弱基質效應，醬油的ME為-22.6%～-32.8%，表現為中等基質效應。為避免基質效應的影響，采用內標法定量。

2.5 線性方程、檢出限與定量限

采用內標校正法，配制質量濃度為3、5、10、20、50、100、200 ng/mL的系列標準工作溶液（內標質量濃度為20 ng/mL），以曲酸的質量濃度（x）為橫坐標，以曲酸與U-[13C6]-曲酸的峰面積比值（y）為縱坐標，繪制標準工作曲線，得曲酸質量濃度在3～200 ng/mL范圍內線性關系良好，線性方程為y= 0.040 421 8x+0.011 672 0，相關系數r為0.999 0。3倍信噪比(S/N)確定曲酸的檢出限為1 μg/kg，10倍信噪比(S/N)確定曲酸的定量限為3 μg/kg。

2.6 加標回收與精密度試驗

按低、中、高3個水平的添加濃度對3種常見空白液態發酵樣品進行加標回收試驗，平行測定6次，試驗結果見表3。由表3可知，曲酸的平均回收率為85.88%～101.72%，測定結果的相對標準偏差為2.45%～9.38%，該方法準確度高，重復性好。

表3   曲酸的加標回收率和精密度

Tab. 3   Recoveries and relative standard deviations o f kojic acid

 

3. 結語

 

建立了一種快速測定液態發酵樣品中曲酸含量的高效液相色譜-串聯質譜法。在傳統QuEChERS快速處理樣品基礎上，對提取溶劑、除水劑和凈化劑的種類和用量展開考察，并進行方法驗證。結果表明該方法預處理簡單，方便快速，具有較高的靈敏度、準確度和精密度，為液態發酵樣品的食用安全性評價提供基礎研究，并大大提高了檢測工作效率。

 

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引用本文： 熊慧霞，郭舒崗，張蕤，等 . 液相色譜串聯質譜法測定液態發酵食品中曲酸［J］. 化學分析計量，2024，33（12）：64. (XIONG Huixia, GUO Shugang, ZHANG Rui, et al. Determination of kojic acid in liquid fermented food by liquid chromatography tandem mass spectrometry[J]. Chemical Analysis and Meterage, 2024, 33(12): 64.)