北京大學(xué)深圳醫(yī)院骨關(guān)節(jié)科陳英奇副研究員、王德利主任和西南交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院萬國江教授在科愛創(chuàng)辦的期刊Bioactive Materials上聯(lián)合發(fā)表文章：可降解鋅表面成血管-成骨耦合和抗破骨的金屬-有機/無機雜化涂層用于骨質(zhì)疏松性骨折修復(fù)。該研究針對骨質(zhì)疏松性骨折修復(fù)的難點，在可降解鋅金屬表面開發(fā)了一種唑來膦酸介導(dǎo)的硅酸鋅/鈣金屬-有機/無機雜化涂層。該涂層具有均勻的微/納米顆粒狀結(jié)構(gòu)，可改善鋅基材腐蝕模式并降低其腐蝕速率，避免植入大鼠股骨骨折后的過早斷裂失效。該涂層可在較長時間內(nèi)續(xù)釋放 Zn2+/Ca2+/Si4+和ZA分子，對血管化骨再生有顯著促進(jìn)效果。改性的髓內(nèi)釘通過內(nèi)皮細(xì)胞和骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞之間的自分泌和旁分泌效應(yīng)增強成血管-成骨耦聯(lián)作用，并抑制了破骨細(xì)胞活性。這種方法為可生物降解金屬的表面工程提供了一種新策略。

1. 研究背景

骨質(zhì)疏松癥(OP)是一種常見的代謝性骨病，常發(fā)生于60歲以上的老年人。隨著全球老齡化的加劇，OP已成為一個重要的公共衛(wèi)生問題。根據(jù)多中心流行病學(xué)調(diào)查預(yù)測，到2050年，OP患者將超過1.2億，給社會和患者帶來沉重的經(jīng)濟負(fù)擔(dān)。OP的主要特征為骨微結(jié)構(gòu)的破壞和骨量的減少，這導(dǎo)致骨骼脆性增加，骨折風(fēng)險加大。因成骨活性受到抑制、血管生成能力受損以及破骨細(xì)胞活性亢進(jìn), OP患者的骨折修復(fù)困難。此外，OP患者的血液供應(yīng)較差，血管數(shù)量較少，血小板內(nèi)皮細(xì)胞粘附分子-1(CD31)和血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)表達(dá)水平較低。因此，OP骨折的治療需要調(diào)節(jié)成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞的功能平衡，并通過促進(jìn)血管生成和成骨耦合來促進(jìn)骨再生。

目前，OP骨折通常采用金屬骨植入裝置進(jìn)行治療，如螺釘、鋼板、髓內(nèi)釘(IMN)和克氏針等。然而，鈦合金(Ti6Al4V)、不銹鋼和鈷鉻合金等傳統(tǒng)惰性金屬制備的植入體存在一系列問題：如二次取出手術(shù)、機械性能不匹配和缺乏“血管生成-成骨-抗破骨”的生物功能。近年來，鎂(Mg)、鐵(Fe)和鋅(Zn)等可降解金屬因其臨時支撐和生物吸收特性受到關(guān)注，能夠有效規(guī)避上述問題。然而，Mg基植入物因腐蝕速度過快導(dǎo)致早期斷裂，F(xiàn)e基植入物因降解速度過慢和腐蝕產(chǎn)物堆積而限制其在骨科的應(yīng)用。而Zn因其適中的腐蝕速度、良好的機械性能和潛在生物活性，被認(rèn)為是有前景的骨折固定材料。Zn作為人體重要的微量元素，參與多種生理活動，適量的Zn2+具有良好的生物功能，如抑制骨溶解，促進(jìn)骨形成、礦化和血管生成。然而，Zn金屬易發(fā)生局部腐蝕，Zn2+的爆發(fā)式釋放、表面生物功能缺乏(尤其在血管生成-成骨-抗破骨耦合方面)限制了其在OP骨折修復(fù)中的應(yīng)用。表面改性可以有效改善這些問題。

表面改性是調(diào)節(jié)Zn金屬腐蝕行為和提高生物相容性的常用方法。近年來，人們開發(fā)了從無機、到有機及復(fù)合材料的多種涂層類型，以對Zn生物金屬進(jìn)行表面改性。例如，無機化合物包括金屬氧化物/氫氧化物(如ZrO2、ZnO、Zn(OH)2)、磷酸鹽(如ZnP、SrP和CaP)等；有機化合物包括膠原蛋白(Col)、聚多巴胺(PDA)和磷酸膽堿-殼聚糖；復(fù)合涂層則有加入膠原蛋白的CaP涂層、摻入雙膦酸鹽/氨基酸/蛋白質(zhì)的ZnP涂層等。這些涂層能有效調(diào)控Zn基體的腐蝕行為和細(xì)胞相容性，但因成分結(jié)構(gòu)簡單、缺乏針對性設(shè)計，無法滿足OP骨折修復(fù)的多功能需求。基于金屬有機/無機雜化涂層的多種成分、穩(wěn)定的化學(xué)結(jié)構(gòu)和可控釋放特性，有望提供血管生成-成骨-抗破骨的多功能涂層，滿足OP骨折修復(fù)的需求。

唑來膦酸(ZA)是一種常用于代謝性骨病患者的雙膦酸鹽(BP)，具有良好的抗破骨作用，是OP的首選治療藥物。然而，ZA全身性使用存在副作用，如腎損傷和非典型股骨骨折。局部應(yīng)用ZA可在保持療效的前提下避免這些副作用。已有研究嘗試將ZA沉積在CaP涂層、聚合物溶液或ZnP復(fù)合涂層中，以緩解其全身性副作用。然而，目前的涂層系統(tǒng)難以實現(xiàn)ZA分子的可控持續(xù)釋放，并缺乏促進(jìn)血管生成的功能，且ZA過高的局部濃度會抑制血管生成，影響骨折修復(fù)效果。因此，需要一種方法來實現(xiàn)ZA的可控釋放，防止抗血管生成作用，同時促進(jìn)血管生成的恢復(fù)和骨壞死的預(yù)防。

在眾多生物活性陶瓷中，生物可吸收的硅酸鈣(CS)表現(xiàn)出較高的生物活性，能快速誘導(dǎo)骨狀磷灰石層的形成，促進(jìn)良好的骨整合。CS基生物材料通常具有類似天然骨的分層結(jié)構(gòu)，孔隙率和互連性適中，有利于骨傳導(dǎo)和血管生成。此外，硅離子通過激活ERK通路促進(jìn)成骨和VEGF表達(dá)，進(jìn)一步加速骨再生。然而，單一的CS涂層存在溶解快、易磨損等問題。引入具有螯合能力的生物活性分子如ZA，與CS形成雜化涂層，不僅可提高其穩(wěn)定性、調(diào)節(jié)ZA的釋放，還可賦予其血管生成-成骨-抗破骨的多重生物功能，為OP骨折的愈合提供支持。

研究人員通過浸涂法在金屬Zn上構(gòu)建了含ZA的硅酸鈣鋅(Ca(Zn)Si)金屬-有機/無機雜化涂層，ZA通過與PDA的氨基/酚羥基反應(yīng)固定于預(yù)處理的Zn表面，Ca2+和Zn2+與ZA的膦酸基配位并誘導(dǎo)無機硅酸相沉積，形成Ca(Zn)Si涂層，并實現(xiàn)ZA的均勻分布和可控釋放(圖1)。通過實驗驗證了該涂層的形貌、化學(xué)成分及體外性能，采用轉(zhuǎn)錄組測序、RT-qPCR和蛋白質(zhì)印跡(WB)分析了成骨和血管生成的分子機制，最后將該涂層的Zn基髓內(nèi)釘植入大鼠OP骨折模型中，探討了其功能和生物降解行為。

圖1. ZA&Ca(Zn)Si 金屬-有機/無機雜化涂層改性髓內(nèi)釘?shù)闹苽浼捌浯龠M(jìn)大鼠骨質(zhì)疏性股骨骨折愈合示意圖

2. 重要研究結(jié)果

ZA&Ca(Zn)Si金屬-有機/無機雜化涂層表面呈現(xiàn)出微/納米級顆粒狀，涂層的主要元素為O、Si、P、Ca、Zn、C、N和P。ZA&Ca(Zn)Si涂層結(jié)構(gòu)更緊湊，厚度較Ca(Zn)Si涂層薄，為19.8 ± 0.1 μm 。涂層的主要無機相為Zn3(PO4)2·4H2O、CaSiO3及CaZnSiO4。紅外光譜結(jié)果和X-射線光電子能譜證實了ZA分子成功摻入到涂層中。相比于純Zn，ZA&Ca(Zn)Si涂層具有更好的親水性和更高的表面能。膠帶和劃痕實驗測試結(jié)果顯示，ZACa(Zn)Si涂層具有較好的結(jié)合力(圖2)。

圖2. ZA&Ca(Zn)Si 金屬-有機/無機雜化涂層的制備及材料表征

采用動電位極化(PDP)和電化學(xué)阻抗譜(EIS)測試探究純Zn和ZA&Ca(Zn)Si涂層改性Zn的腐蝕行為。根據(jù)PDP曲線，與純Zn相比，涂層改性Zn的陰極反應(yīng)被顯著抑制。ZA&Ca(Zn)Si涂層樣品的自腐蝕電位(Ecorr)、自腐蝕電流密度(icorr)和腐蝕速率均低于純Zn和Ca(Zn)Si涂層樣品。ZA&Ca(Zn)Si涂層樣品的阻抗明顯高于純Zn和Ca(Zn)Si涂層樣品，擬合結(jié)果也表明改性涂層具有更高的表面涂層阻抗和界面轉(zhuǎn)移電阻。長期浸泡結(jié)果表明ZA&Ca(Zn)Si涂層樣品能夠誘導(dǎo)腐蝕產(chǎn)物均勻沉積、減緩了Zn2+的釋放、調(diào)控了Si4+、Ca2+和ZA分子的釋放。此外，該雜化涂層的致密結(jié)構(gòu)有效阻隔腐蝕介質(zhì)的滲入，防止了局部腐蝕和點蝕發(fā)生(圖3)。

圖3. ZA&Ca(Zn)Si金屬-有機/無機雜化涂層的體外腐蝕降解行為評價

通過對HUVECs轉(zhuǎn)錄組測序，探究ZA&Ca(Zn)Si改性鋅金屬促血管生成的潛在機制。在37895個基因中共有761個差異表達(dá)基因(DEGs)，其中583個上調(diào)，178個下調(diào)。與對照組相比，ZA&Ca(Zn)Si改性的樣品上調(diào)了一些與血管生成相關(guān)的典型基因，包括丙酮酸脫氫酶激酶1 (PDK1)和磷酸甘油酸激酶1 (PGK1)。PDK1是一種關(guān)鍵的糖酵解酶，主要分布在線粒體基質(zhì)中，是HIF-1的下游靶基因之一。抑制 PDK1可能會降低HIF-1的表達(dá)，從而減少新生血管形成。PGK1 也是HIF-1的靶基因，參與血管形成。此外，成骨相關(guān)基因如轉(zhuǎn)化生長因子α (TGFA)在暴露于樣品提取物后上調(diào)。TGFA 是組織愈合的重要介質(zhì)，在成骨中起關(guān)鍵作用。基于京都基因與基因組百科全書(KEGG)富集分析，ZA&Ca(Zn)Si改性樣品浸提液上調(diào)了HIF-1和Wnt信號通路，它們對細(xì)胞生長、遷移和血管形成至關(guān)重要。基因集富集分析(GSEA)表明，ZA&Ca(Zn)Si 改性樣品提取物激活了 Notch 和鈣離子信號通路。WB分析進(jìn)一步ZA&Ca(Zn)Si改性樣品浸提液促進(jìn)了HIF-1和VEGF蛋白質(zhì)的表達(dá)(圖4)。

圖4. ZA&Ca(Zn)Si 金屬-有機/無機雜化涂層促血管生成的機制研究

為了深入了解 ZA&Ca(Zn)Si 涂層對成骨分化的潛在調(diào)控機制，對與該樣品提取物孵育的 BMSCs 進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄組測序。與對照組相比，35222個基因中有 2335個DEGs，其中573個基因上調(diào)，1762個下調(diào)基因。一些與成骨分化相關(guān)的典型基因上調(diào)，包括鋅指和同源盒蛋白(Zhx3)和骨調(diào)節(jié)蛋白(Omd)。Zhx3 通過調(diào)節(jié)下游基因，如 Runx2 和 osterix的表達(dá)參與成骨分化的初始階段。Omd是一種小蛋白多糖，分布在礦化組織(骨骼和牙齒)中，參與細(xì)胞粘附和骨礦化調(diào)節(jié)。與對照組相比，暴露于 ZA&Ca(Zn)Si改性樣品的提取物后，與新生血管形成相關(guān)的基因—VEGFD、血清/糖皮質(zhì)激素調(diào)節(jié)激酶1 (SGK1)和谷氨酰胺合成酶(GLUL)上調(diào)。VEGF 是血小板衍生生長因子家族的一員，可促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞生長和血管生成。SGK1是血管重塑過程中的必需酶，參與內(nèi)皮細(xì)胞的生長、增殖和遷移。GLUL 是血管發(fā)育和內(nèi)皮細(xì)胞遷移中必不可少的酶。這些血管生成相關(guān)基因的上調(diào)表明，BMSCs 可能通過旁分泌將這些蛋白質(zhì)/酶釋放到周圍環(huán)境中，并作用于內(nèi)皮細(xì)胞促進(jìn)血管生成。GO 分析揭示了幾個生物過程、細(xì)胞成分和分子功能的富集。KEGG 富集分析表明絲裂原活化蛋白激酶(MAPK/ERK)、磷酸肌醇3-激酶-Akt (PI3K/Akt)、Wnt/β-catenin 和 Janus 激酶/信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子(JAK/STAT)的富集，它們參與了成骨細(xì)胞增殖、分化、存活和成骨過程。WB結(jié)果證實了MAPK/ERK信號通路相關(guān)的蛋白在ZA&Ca(Zn)Si改性樣品浸提液的刺激下上調(diào)(圖5)。

圖5. ZA&Ca(Zn)Si金屬-有機/無機雜化涂層促成骨生成的機制研究

HUVEC 和 BMSC 之間的旁分泌作用，即血管生成-成骨耦合作用，對骨再生至關(guān)重要。使用 Transwell 共培養(yǎng)系統(tǒng)研究樣品浸提液作用下BMSCs對HUVECs的影響。結(jié)晶紫染色顯示，與純 Zn 和對照提取物相比，ZA&Ca(Zn)Si改性樣品中遷移的 HUVEC 更多。在 ZA&Ca(Zn)Si改性鋅的浸提液刺激下，形成了更多的網(wǎng)絡(luò)狀結(jié)構(gòu)。進(jìn)一步探究了BMSCs對HUVECs的旁分泌作用，與純 Zn 和對照組相比，ZA&Ca(Zn)Si組促進(jìn)了更多的BMSCs遷移和ALP表達(dá)，表明具有更高的成骨分化能力。這些結(jié)果證實，在ZA&Ca(Zn)Si樣品浸提液的影響下，HUVEC 和 BMSC 之間的血管生成-成骨耦合顯著增強(圖6)。

圖6. ZA&Ca(Zn)Si 金屬-有機/無機雜化涂層介導(dǎo)的成血管-成骨耦合作用

骨髓單核細(xì)胞(BMMs)是骨吸收實驗中常用的細(xì)胞模型，用于研究 ZA&Ca(Zn)Si 涂層樣品對破骨細(xì)胞增殖和分化的影響。與純 Zn、Ca(Zn)Si 涂層和對照樣品相比，ZA&Ca(Zn)Si 涂層樣品上的紫色TRAP陽性破骨細(xì)胞較少，破骨細(xì)胞活性更低且尺寸更小，且隨著ZA 濃度的增加，抗破骨細(xì)胞活性呈下降趨勢(圖7)。

圖7. ZA&Ca(Zn)Si 金屬-有機/無機雜化涂層的抗破骨效應(yīng)及機制

采用大鼠股骨骨質(zhì)疏松性骨折模型探究ZA&Ca(Zn)Si改性的鋅基髓內(nèi)釘促進(jìn)骨再生的能力。采用的髓內(nèi)釘尺寸為：長度28 ± 0.1 mm，直徑為1.6 ± 0.05 mm。術(shù)后24小時各組股骨斷端對位良好，髓內(nèi)釘沒有發(fā)生位移，植入體周圍沒有感染。植入4周后，Ti6Al4V組觀察到明顯斷裂線，純Zn發(fā)生輕微的彎曲。植入8周后，Ti6Al4V組斷裂線仍然明顯，純Zn發(fā)生了嚴(yán)重的彎曲。術(shù)后16周，Ti6Al4V組髓內(nèi)釘周圍出現(xiàn)較厚的骨痂，純Zn斷裂，植入失敗。ZA&Ca(Zn)Si髓內(nèi)釘周圍骨痂被吸收，斷裂完全修復(fù)。定量數(shù)據(jù)愈合分?jǐn)?shù)顯示，ZA&Ca(Zn)Si改性的鋅基髓內(nèi)釘具有最高評分。Micro-CT 圖像顯示出與 X 射線相同的結(jié)果。植入后 16 周，ZA&Ca(Zn)Si 涂層改性的鋅基髓內(nèi)釘幾乎完全修復(fù)的骨折。骨密度(BMD)、骨體積占總體積的百分比(BV/TV) 、骨小梁數(shù)量(Tb. N)和骨小梁厚度(Tb. Th)與骨折愈合評分表現(xiàn)出相同的趨勢。此外，ZA&Ca(Zn)Si涂層改性的鋅基髓內(nèi)釘顯示出最低的骨小梁間隔(Tb. Sp)。這些結(jié)果表明，ZA&Ca(Zn)Si涂層改性的鋅基髓內(nèi)釘加速了骨質(zhì)疏松性骨折的愈合(圖8)。

圖8. ZA&Ca(Zn)Si 金屬-有機/無機雜化涂層改性鋅基髓內(nèi)釘在大鼠骨質(zhì)疏松性股骨骨折模型中的X射線和Micro-CT結(jié)果

通過H&E、Masson、Goldner和免疫組織化學(xué)染色評估骨再生。H&E染色顯示Ti6Al4V組中有一條清晰的骨折線。在純 Zn組中，由于髓內(nèi)釘過早骨折導(dǎo)致骨折愈合不良，出現(xiàn)大量新形成的纖維組織。Ca(Zn)Si改性的髓內(nèi)釘這組也出現(xiàn)骨折線。相比之下，ZA&Ca(Zn)Si組表現(xiàn)出相對不明顯的骨折線，靠近骨折部位的膠原蛋白分化為新的小梁骨，表現(xiàn)為紫色的蜂窩狀組織，表明愈合狀態(tài)良好。Masson染色顯示， Ti6Al4V組的骨折部位處幾乎沒有新形成的膠原蛋白。在純 Zn組中，斷裂末端由豐富的膠原纖維連接。Ca(Zn)Si改性的髓內(nèi)釘組發(fā)現(xiàn)部分礦化膠原蛋白。ZA&Ca(Zn)Si改性髓內(nèi)釘組染成深紅色，表明更多的礦化骨形成。Goldner染色顯示了類似的結(jié)果，與其他三組相比，ZA&Ca(Zn)Si改性髓內(nèi)釘組有更多的礦化新骨染成綠色，這意味著骨愈合更好(圖9)。

圖9. ZA&Ca(Zn)Si 金屬-有機/無機雜化涂層改性鋅基髓內(nèi)釘促進(jìn)大鼠骨質(zhì)疏松性股骨骨折染色結(jié)果

總之，ZA&Ca(Zn)Si 金屬-有機/無機雜化涂層對修復(fù)骨質(zhì)疏松性骨折表現(xiàn)出非凡的療效。基于ZA 和 Ca2+和Zn2+的配位與無機相的原位形核生長成功制備了ZA介導(dǎo)的Ca(Zn)Si 雜化涂層，該涂層具有致密的顆粒狀微/納米結(jié)構(gòu)。與純 Zn 和 Ca(Zn)Si 改性樣品相比，ZA&Ca(Zn)Si 涂層調(diào)節(jié)了鋅的腐蝕模式并降低了其腐蝕速率，防止了體內(nèi)過早斷裂失，并維持了活性物質(zhì)的持續(xù)釋放。雜化涂層通過多種信號通路和耦聯(lián)效應(yīng)調(diào)節(jié)細(xì)胞反應(yīng)，Zn2+、Ca2+ 、Si4+和ZA 協(xié)同作用促進(jìn)了HUVECs和BMSCs的增殖和分化。這些活性物質(zhì)進(jìn)一步增強了HUVECs 和BMSCs之間的旁分泌作用，調(diào)節(jié)血管生成-成骨耦合并加速早期血管形成和成骨分化，創(chuàng)造了一個合適的骨愈合微環(huán)境。此外，雜化涂層釋放的Zn2+和ZA分子抑制了破骨細(xì)胞的分化。綜上所述，本研究為開發(fā)用于骨質(zhì)疏松性骨折的內(nèi)固定植入物提供了一定基礎(chǔ)。

原文信息

Junyu   Qian#, Haotian Qin#, En Su, Jiaming Hou, Hui Zeng,   Tianbing Wang, Deli Wang*, Guojiang Wan*, Yingqi Chen*.   Angiogenesis-osteogenesis coupling and anti-osteoclastogenesis zoledronate   intermixed calcium silicate metal-organic/inorganic hybrid coating on   biodegradable zinc-based intramedullary nails for osteoporotic fracture   healing. Bioactive Materials, 44   (2025) 46-67. 

DOI:https://doi.org/10.1016/j.bioactmat.2024.09.041