膠原蛋白是細胞外基質中重要的結構成分，分布于所有組織和器官。它不僅賦予組織強度、耐久性和彈性，還廣泛參與各種生物過程。膠原蛋白應用廣泛，涵蓋醫療美容、功效護膚、嚴肅醫療及其他消費等領域。

肽圖檢測法

肽圖檢測法利用特定的化學試劑或酶將蛋白質特異性降解為肽段，然后通過分離和鑒定，并與經同一方法處理的對照品進行比較和結果判定。根據所選用的檢測儀器不同，肽圖分析可以分為基于高效液相色譜法的肽圖分析和基于質譜法的肽圖分析。

通過與對照品肽圖的比較，可以對生產過程中的膠原蛋白的質量進行評估和監控，確保產品的一致性和質量穩定性。

基于反相高效液相色譜法的肽圖分析

反相高效液相色譜（RP-HPLC）法是一種操作簡單、檢測靈敏度高的分析方法，可提供豐富的蛋白質和肽段信息，是蛋白質和肽段分析與表征的標準方法。

HPLC肽圖分析通常用于常規鑒別試驗。在該分析中，肽段經過色譜柱分離后，使用紫外檢測器在波長范圍200~230 nm（通常為214 nm）記錄色譜圖。通過將供試品溶液的色譜圖與對照品相比較，最終可以對膠原蛋白類產品進行肽圖鑒別。

HPLC肽圖分析的實驗步驟通常包括供試品和對照品的預處理（如溶解、變性）、膠原蛋白的特異性裂解、肽段的分離和檢測，以及結果的分析和判定。

膠原蛋白相關標準及肽圖檢測依據

以上這些標準基本都是依據《中國藥典》2020 四部 肽圖檢查法 法一或結合質譜法進行肽圖分析的。

△《中國藥典》2020 四部 3405 肽圖檢查法 法一 胰蛋白酶裂解-反相高效液相色譜法

△《中國藥典》2020 四部 0431 質譜法，采用適宜的質譜技術對各色譜峰對應的肽段進行定性

1、檢測樣品

牛I型膠原蛋白凍干品

2、實驗儀器

高效液相色譜儀（紫外檢測器）

高分辨液質聯用儀

3、結果展示

牛I型膠原蛋白凍干品（供試品和對照品）酶解6 h后的樣品經過HPLC的分離，紫外檢測器采集數據，得到肽圖結果，色譜圖如圖1。根據上述色譜圖分析結果，可以發現供試品中的主要肽段出峰時間和相對比例（響應強度）與對照品基本一致。牛I型膠原蛋白凍干品（供試品和對照品）酶解6 h后的樣品經過HPLC的分離，紫外檢測器采集數據，得到肽圖結果，色譜圖如圖1。

經過高分辨質譜對肽段進行進一步分析和驗證，發現基本都是帶兩個或三個電荷肽段 ，如圖2和圖3所示。因此，進一步確認酶解確實生成了肽段，且供試品和對照品結果一致。

圖1 胰蛋白酶酶解6 h的肽圖

（黑色：空白對照；紅色：對照品；藍色：供試品）

圖2 胰蛋白酶酶解6 h的TIC圖

（紅色：空白對照；綠色：對照品；紫色：供試品）

圖3 提取12.6 min左右的質譜圖

（紫色：空白對照；綠色：對照品；紅色：供試品）

膠原蛋白的肽圖分析除使用液相色譜法進行鑒別外，還可以使用 LC-MS/MS 對生成的特征多肽進行測定。以不同類型膠原蛋白特征多肽的保留時間(RT)和二級子離子碎片的質荷比(m/z)進行定性和確證，以合成的不同類型膠原蛋白特征多肽作為對照品，用外標法或內標法對膠原蛋白多肽進行定量，可以間接反映膠原蛋白的含量。