摘 要： 建立高效液相色譜法同時測定暈可平糖漿中5-羥甲基糠醛、丹參素、原兒茶醛、咖啡酸、苯甲酸、毛蕊花糖苷、異毛蕊花糖苷、迷迭香酸、甘草酸9種成分的含量。采用Phenomenex luna C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），以乙腈-0.05%三氟乙酸溶液為流動相進行梯度洗脫，流量為1 mL/min，柱溫為25 ℃，檢測波長分別為245 nm（苯甲酸、甘草酸）、280 nm（5-羥甲基糠醛、丹參素、原兒茶醛）和330 nm（咖啡酸、毛蕊花糖苷、異毛蕊花糖苷、迷迭香酸）。9種成分的質量濃度在各自范圍內與對應的色譜峰面積線性關系良好，相關系數均為0.999 9，方法檢出限為0.01～0.21 μg/mL，定量限為0.02～0.68 μg/mL。樣品加標平均回收率為96.9%～105.0%，測定結果的相對標準偏差為1.3%～3.4%（n=6）。該方法簡便可靠，重復性好，可用于暈可平糖漿的質量控制。

關鍵詞： 暈可平糖漿； 指標成分； 高效液相色譜法

 

暈可平糖漿是由生赭石、夏枯草、法半夏、車前草4味中藥組成的中藥制劑，并加入矯味劑蔗糖、pH調節劑枸櫞酸及抑菌劑苯甲酸鈉，具有潛陽鎮肝之功效，主治肝旺痰阻型的內耳眩暈癥、頭暈、目眩癥。研究發現眩暈癥多次發作后會影響大腦微循環，造成腦供血不足，而暈可平制劑能增強腦組織對缺血、缺氧的耐受力[1?2]。處方中夏枯草含有酚酸類化合物丹參素、原兒茶醛、咖啡酸和迷迭香酸，這4種成分均具有抗腦缺血作用[3?7]；法半夏的入血成分有原兒茶醛和甘草酸[8]，甘草酸對出血性、缺血性或缺血-再灌注性腦損傷以及化學品造成的神經損傷有顯著保護作用[9]；車前草含有咖啡酸、毛蕊花糖苷和異毛蕊花糖苷[10?11]，毛蕊花糖苷與異毛蕊花糖苷互為同分異構體，在煎煮或弱酸性條件下毛蕊花糖苷可轉化為異毛蕊花糖苷，兩者藥理活性相似，均具有抗氧化和神經保護作用[12?14]。

此外，糖漿的輔料主要有蔗糖、枸櫞酸和苯甲酸鈉。在酸性條件下，蔗糖溶液長時間高溫加熱或低溫貯藏會產生5-羥甲基糠醛，且枸櫞酸和暈可平糖漿中的金屬離子Ca2+、Mg2+能加快蔗糖形成5-羥甲基糠醛的速率[15?18]。5-羥甲基糠醛具有抗心肌缺血、改善血液流變性等作用，但同時也存在致突變性和遺傳毒性等毒副作用，且毒性具有濃度依賴性效應[19]。另一輔料苯甲酸鈉的用量不足會增加微生物污染的風險，使用過量存在蓄積毒性、生殖毒性、神經毒性和致突變的作用[20]。

暈可平糖漿現收載于《中華人民共和國衛生部藥品標準》中藥成方制劑第二冊，標準號為WS3-B-0372-90，該標準僅有性狀和檢查項，無含量測定項。筆者等[21]曾對暈可平糖漿中迷迭香酸單一成分進行了測定，但單一指標的評價模式難以反映中藥制劑整體質量，多指標成分測定已成為全面評價制劑質量的可靠模式[22]，但目前尚未見同時測定暈可平糖漿中多種指標成分的方法。中藥制劑中指標成分的測定方法主要有高效液相色譜法和液相色譜-串聯質譜法。上述兩種方法均具有高效、靈敏、準確、穩定的特點，其中高效液相色譜法具有操作簡便、檢測成本相對較低的優勢，應用范圍更廣，因此筆者建立高效液相色譜法同時測定暈可平糖漿中5-羥甲基糠醛、丹參素、原兒茶醛、咖啡酸、苯甲酸、毛蕊花糖苷、異毛蕊花糖苷、迷迭香酸和甘草酸9種成分，以期為該制劑質量控制及臨床療效評價提供技術支持。

 

1、 實驗部分

 

1.1 主要儀器與試劑

高效液相色譜儀：Agilent1260型，配二極管陣列檢測器(DAD)，安捷倫科技(中國)有限公司。

電子天平：XS205型，感量為0.01 mg，梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司。

超純水系統：Milli-Q Advantage A10型，默克化工技術(上海)有限公司。

超聲波清洗器：B3200-T型，上海必能信超聲有限公司。

5-羥甲基糠醛、丹參素鈉、原兒茶醛、咖啡酸、苯甲酸鈉、毛蕊花糖苷、迷迭香酸、甘草酸銨對照品：純度(質量分數)分別為99.5%、97.8%、99.6%、99.7%、99.8%、95.2%、98.1%、96.2%，中國食品藥品檢定研究院。

異毛蕊花糖苷對照品：純度(質量分數)為98%，成都克洛瑪生物科技有限公司。

三氟乙酸、乙腈：色譜純，美國TEDIA公司。

甲醇：色譜純，國藥集團化學試劑有限公司。

暈可平糖漿樣品：共10批，批號分別為61200402、61200902、61201001、61201202、61210801、61220102、61220304、61220502、61220601、61221101，市售。

實驗所用其他試劑均為分析純。

實驗用水為超純水。

1.2 色譜條件

色譜柱：Phenomenex luna C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm，天津博納艾杰爾科技有限公司)；流動相：A相為乙腈，B相為0.05%(體積分數，下同)三氟乙酸溶液，流量為1 mL/min；洗脫方式：梯度洗脫，洗脫程序見表1；柱溫：25 ℃；檢測器：二極管陣列檢測器(DAD)；檢測波長：苯甲酸、甘草酸為245 nm，5-羥甲基糠醛、丹參素、原兒茶醛為280 nm，咖啡酸、毛蕊花糖苷、異毛蕊花糖苷、迷迭香酸為330 nm；進樣體積：10 μL。

表1   梯度洗脫條件

Tab. 1   Conditions of mobile phase in gradient elution

 

1.3 溶液制備

對照品儲備液：精密稱取各對照品適量，用75%(體積分數，下同)甲醇溶液溶解并稀釋，配制成5-羥甲基糠醛、丹參素(以丹參素鈉質量的0.9倍計)、原兒茶醛、咖啡酸、苯甲酸(由苯甲酸鈉質量換算)、毛蕊花糖苷、異毛蕊花糖苷、迷迭香酸、甘草酸(由甘草酸銨質量換算)的質量濃度分別為1 354.20、2 262.99、1 744.00、1 138.57、16 578.82、1 060.53、981.96、4 228.11、730.90 μg/mL的對照品儲備液。

混合對照品溶液：精密吸取適量各對照品儲備液，置于同一只50 mL棕色容量瓶中，用75%甲醇溶液稀釋至標線，配制成上述9種成分質量濃度分別為54.17、271.56、34.88、22.77、1 657.88、21.21、58.92、845.62、29.24 μg/mL的混合對照品溶液Ⅰ。另精密吸取適量各對照品儲備液，置于同一只100 mL棕色容量瓶中，同法配制成上述9種成分質量濃度分別為2.71、108.62、14.82、10.82、795.78、14.85、53.03、105.70、6.58 μg/mL的混合對照品溶液Ⅱ。

系列混合對照品溶液：精密量取0.2、0.5、1、2.5、5、10 mL混合對照品溶液Ⅰ，分別置于6只10 mL棕色容量瓶中，用75%甲醇溶液稀釋至標線，搖勻，得系列混合對照品溶液，9種成分的質量濃度見表2。

表2   系列混合對照品溶液9種成分的質量濃度

Tab. 2   Mass concentrations of 9 components in a series of mixed reference solutions ( μg/mL )

 

樣品溶液：精密量取暈可平糖漿樣品5 mL，置于25 mL棕色容量瓶中，加入75%甲醇溶液定容至標線，冰浴超聲處理(功率為250 W，頻率為33 kHz)5 min，用75%甲醇溶液定容至標線，搖勻，以0.45 μm微孔濾膜過濾，取續濾液，作為樣品溶液。

陰性樣品溶液：按照處方比例和制備工藝，分別制備不含夏枯草、不含法半夏、不含車前草、不含蔗糖和防腐劑的陰性樣品，并按樣品溶液制備方法同法制備陰性樣品溶液。

1.4 實驗方法

取混合對照品溶液Ⅰ和樣品溶液，按1.2色譜條件進樣測定，記錄色譜圖峰面積，以外標法計算樣品中各指標成分的含量。

 

2、 結果與討論

 

2.1 流動相選擇

分別考察乙腈-0.1%甲酸溶液、乙腈-0.1%磷酸溶液、乙腈-0.05%三氟乙酸溶液、甲醇-0.05%三氟乙酸溶液4種流動相體系。結果發現，以乙腈-0.05%三氟乙酸溶液為流動相時，色譜圖基線平穩、色譜峰形尖銳、對稱，各目標成分的分離度符合要求；以其他3種溶液為流動相時，丹參素和迷迭香酸與前后雜質峰的分離度小于1.5，因此選擇乙腈-0.05%三氟乙酸溶液作為流動相。

2.2 檢測波長選擇

采用DAD檢測器在200～400 nm波長范圍內對各成分進行掃描，5-羥甲基糠醛、丹參素、原兒茶醛、咖啡酸、苯甲酸、毛蕊花糖苷、異毛蕊花糖苷、迷迭香酸和甘草酸的最大吸收波長分別為284、280、280、322、230、330、326、330、252 nm。結合雜質干擾和指標成分靈敏度選擇檢測波長，確定苯甲酸、甘草酸的檢測波長為245 nm，5-羥甲基糠醛、丹參素、原兒茶醛的檢測波長為280 nm，咖啡酸、毛蕊花糖苷、異毛蕊花糖苷、迷迭香酸的檢測波長為330 nm。

2.3 指標成分選擇

根據《中華人民共和國藥典》(2020年版)夏枯草、車前草的質量控制要求，選擇糖漿中5-羥甲基糠醛、丹參素、原兒茶醛、咖啡酸、苯甲酸、毛蕊花糖苷、異毛蕊花糖苷、迷迭香酸、甘草酸和大車前苷10種成分進行測定。結果發現，糖漿中未檢出大車前苷(檢出限為0.02 μg/mL)。大車前苷屬于苯乙醇苷類化合物，高溫、高pH值、光照和金屬離子會導致苯乙醇苷類成分降解[23]，故推測大車前苷在制劑過程中發生降解，故選擇5-羥甲基糠醛、丹參素、原兒茶醛、咖啡酸、苯甲酸、毛蕊花糖苷、異毛蕊花糖苷、迷迭香酸和甘草酸9種指標成分。

2.4 提取方法選擇

分別考察冰浴超聲和加熱回流兩種提取方式。結果發現，采用加熱回流提取樣品時，5-羥甲基糠醛的含量較高，與溫度升高可促進5-羥甲基糠醛生成的文獻報道一致[20]，故選擇冰浴超聲提取法。

分別考察水、60%甲醇溶液、70%甲醇溶液、75%甲醇溶液、85%甲醇溶液、甲醇、75%乙醇溶液、乙醇8種溶劑的冰浴超聲提取效果。結果表明，以75%甲醇溶液為溶劑時，毛蕊花糖苷和異毛蕊花糖苷的測定結果最大，各成分色譜峰形較好且雜質干擾小，故選擇75%甲醇溶液作為溶劑。

以75%甲醇溶液為溶劑，分別考察超聲時間為0、5、10、15、30 min時的提取效果[24?26]。結果表明，各成分的提取效果無顯著差異，為確保各成分充分溶解并節省實驗時間，選擇提取時間為5 min。

2.5 專屬性試驗

取混合對照品溶液Ⅰ、樣品溶液、陰性樣品溶液各10 μL，在1.2色譜條件下進樣測定，可以看出，各成分色譜峰與相鄰色譜峰分離度良好，樣品基質無干擾，表明該方法專屬性良好。

 

2.6 線性方程、檢出限和定量限

按1.2色譜條件分別測定系列混合對照品溶液，以質量濃度為橫坐標(x)，以色譜峰面積為縱坐標(y)進行線性回歸，得到線性回歸方程及相關系數。將混合對照品溶液用75%甲醇溶液逐級稀釋，按1.2色譜條件進樣測定，以信噪比為3時的質量濃度為檢出限，以信噪比為10時的質量濃度為定量限。9種成分的質量濃度線性范圍、線性方程、相關系數、檢出限和定量限見表3。由表3可知，各成分在各自質量濃度范圍內與色譜峰面積線性關系良好。

表3   9種成分的質量濃度線性范圍、線性方程、相關系數、檢出限和定量限

Tab. 3   Linear range of mass concentration，linear equation，correlation coefficient，detection limit and quantification limit of 9 components

 

2.7 穩定性試驗

按1.3方法制備樣品溶液(批號為61200902)，分別于第0、3、6、12、18、24 h時進樣測定，結果見表4。由表4可知，5-羥甲基糠醛、丹參素、原兒茶醛、咖啡酸、苯甲酸、毛蕊花糖苷、異毛蕊花糖苷、迷迭香酸、甘草酸色譜峰面積測定結果的相對標準偏差(RSD)分別為1.0%、0.5%、1.4%、0.6%、0.6%、1.6%、0.8%、0.8%、1.2%，表明樣品溶液在24 h內穩定性良好。

表4   穩定性試驗結果

Tab. 4   Results of stability test

 

2.8 樣品加標回收與精密度試驗

取各成分含量已知的樣品(批號為61200902)　6份，每份2.5 mL，精密加入10 mL混合對照品溶液Ⅱ，按1.3方法制備加標樣品溶液，在1.2色譜條件下進樣測定，計算回收率和測定結果的相對標準偏差，結果見表5。由表5可知，5-羥甲基糠醛、丹參素、原兒茶醛、咖啡酸、苯甲酸、毛蕊花糖苷、異毛蕊花糖苷、迷迭香酸、甘草酸的加標平均回收率分別為98.7%、105.0%、99.4%、100.1%、99.6%、103.9%、96.9%、101.2%、98.2%，測定結果的相對標準偏差分別為3.0%、1.6%、2.1%、2.0%、1.3%、2.5%、2.9%、3.1%、3.4%，表明該方法準確度和精密度較高。

表5   加標回收與精密度試驗結果

Tab. 5   Results of spiked recovery and precision test

 

3、 結語

 

建立了高效液相色譜法同時測定暈可平糖漿中5-羥甲基糠醛、丹參素、原兒茶醛、咖啡酸、苯甲酸、毛蕊花糖苷、異毛蕊花糖苷、迷迭香酸、甘草酸9種成分的含量。該方法簡便可靠，重復性好，可用于暈可平糖漿的質量控制，進而為其質量標準提高提供參考。

 

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