體積性肌肉損失通常由創傷事件引起，并可導致嚴重的功能殘疾。由于組織-水凝膠界面處的水化層，傳統的黏合劑水凝膠在潮濕、出血的傷口中表現出較差的組織粘附性，導致性能不足。在這項研究中，我們開發了一種新型的，由葡聚糖醛和明膠組成的濕組織粘合劑粉末水凝膠。該粉末吸收組織上的界面組織液和緩沖溶液，自發形成水凝膠，并通過各種分子相互作用，包括希夫堿反應，強力粘附在組織上。我們的濕粘粉末水凝膠可以作為修復各種組織的有效平臺，包括心臟，肌肉和神經組織。

引言

骨骼肌約占體重的30-40%，主要負責身體運動和產生力量。骨骼肌經常受到不同程度的創傷損傷。創傷性事件常導致體積性肌肉損失(VML)，骨骼肌總量損失大于20%，導致不可逆的肌肉損失、功能受損和長期殘疾。目前臨床治療VML的標準是自體肌瓣移植，然而，它有幾個嚴重的缺點，包括復雜的外科手術，有限的供體部位的可用性和不完全的功能恢復。因此，迫切需要一種簡單有效的治療方法來促進VML骨骼肌再生。

粉末水凝膠被開發出來，通過吸收界面水來消除組織界面水化層，從而實現濕組織粘附。制備的水凝膠具有較強的組織黏附性，為組織再生提供穩定、貼身的支持。粉末水凝膠為組織再生提供了幾個好處，包括快速和大體積去除組織上的水化層，以及適應形狀不規則的傷口部位。一些研究已經證明了粉末水凝膠在各種組織再生中的效用。此外，它在動態環境中的穩定性和性能，包括骨骼肌，仍未被探索。因此，開發具有良好生物相容性、生物可降解性、對動態濕組織具有可靠和強粘附性的粉狀水凝膠是人們迫切需要的。

大多數研究僅關注其對出血傷口的止血性能，尚未探討其在組織再生中的適用性。重要的是，由高度改性聚合物組成的粉末可能會引起嚴重的毒性，副反應以及影響再現性的合成和純化困難。為了解決這些問題，我們的研究通過結合生物相容性天然聚合物，特別是葡聚糖醛(dex-ald)和明膠，開發了一種濕組織粘合劑聚合物粉末水凝膠，旨在VML后骨骼肌再生。通過簡單的改性工藝合成Dex-ald，并與明膠配制，最終得到Dex-ald/明膠粉末。dex-ald/明膠粉末吸收界面組織液，并通過組織上dex-ald和明膠之間的希夫堿反應自發形成原位水凝膠。此外，這種粉末水凝膠主要通過在水凝膠和組織之間形成共價席夫堿而粘附在組織上。我們系統地研究了粉末成分和處理程序對材料性能的影響，如機械、流變學和附著力。此外，我們還利用各種器官對粉末水凝膠的體內性能進行了評估，特別是考察了其黏附強度和止血能力，并與其他濕性水凝膠和纖維蛋白膠進行了比較。最后，通過動物VML模型驗證了粉末水凝膠用于骨骼肌再生的可行性。

結果與討論

1.1.dex-ald/明膠粉末水凝膠的制備

將凍干的Dex-ald和明膠混合勻漿，制備Dex-ald/明膠粉末(圖2A)。均質后，用300μm篩進行篩分。Dex-ald粉末具有短而破碎的纖維形狀，明膠粉末顯示出球形形態。粉末的小粒徑被期望具有大的表面積以進行快速流體吸附，從而導致快速水化和凝膠化(圖2B)。由于界面水大部分被粉末除去，因此在組織/水凝膠界面上沒有水化層，這使得粉末的粘附官能團(如醛、羧基、胺和羥基)能夠有效地反應并與組織結合。由于這些特性，dex-ald/明膠粉末水凝膠可以很強地粘附在濕組織上。用FT-IR光譜檢測PBS處理后形成的粉末水凝膠(圖2C)。Dex-ald和明膠在1735cm−1和1633cm−1處表現出典型的醛鍵峰和酰胺鍵峰。(圖2c)。在dex-ald/明膠水凝膠光譜中，在1056cm−1處出現了席夫堿對應的新峰，而在1735cm−1處的醛峰減弱，表明水凝膠中席夫堿形成成功。進一步孵育后，水凝膠呈現相對均勻的孔隙，表明最終發生交聯反應，內部結構均勻。

1.2.dex-ald/明膠粉末水凝膠的力學特性

通過改變dex-ald與明膠的比例(1:2、1:4、1:8和1:16)，配制出各種dex-ald/明膠粉末，分別稱為粉末(1:2)、粉末(1:4)、粉末(1:8)和粉末(1:16)，并對其流變特性進行了表征(圖3)。首先，在時間掃描模式下監測了PBS處理后粉末水凝膠的流變行為(圖3A和B)。加入PBS后，觀察到兩種不同的模量趨勢-(i)初始模量下降和(ii)模量逐漸增加。對于這一觀察，我們推測粉末可能經歷的兩個事件:(i)初始粉末水化與降低模量和(ii)最終交聯(凝膠)與增加模量。在水化和凝膠化過程中，彈性模量(G′)均高于粘性模量(G″)，表明粉末水凝膠主要表現為凝膠樣行為。由于粉末能迅速吸收溶液，腫脹的粉末即使在早期水化階段也可能表現出凝膠狀的機械行為。顆粒狀水凝膠(由水合微凝膠組成)即使沒有很強的顆粒間相互作用，其G′也比G′高。在我們的研究中，含有更高比例明膠的粉末表現出更快的水化和更短的凝膠時間(圖3C)。粉末(1:2)需要很長時間(約490秒)才能凝膠化，這對于體內應用來說太慢了。此外，明膠比例較高的粉末水凝膠具有更高的模量(圖3D)。我們通過在PBS中孵育制備的粉末水凝膠進一步檢查凝膠穩定性。醛基密集地位于dex-ald鏈上(每葡萄糖單位0.58個醛基)，由于空間位阻，它們與明膠中的胺基反應無效。因此，形成穩定的交聯水凝膠需要醛的含量高于胺的含量。粉末(1:4)中胺基比醛基多3.3倍(圖3E)?；谀z時間、模量和穩定性，確定了1:4的粉狀水凝膠最適合作為原位成型粉狀水凝膠。

1.3.dex-ald/明膠粉末水凝膠的組織粘附性

采用豬皮膚組織進行搭接剪切試驗，評估不同比例(1:2、1:4、1:8和1:16)的粉末水凝膠的組織粘附性(圖4A)。與商業纖維蛋白膠(2.8kPa)相比，粉末水凝膠具有更高的粘附強度(7.5-15.2kPa)(圖4B)。粉末水凝膠的強組織粘附性可歸因于組織/水凝膠界面上的共價鍵和非共價鍵。dex-ald中的醛基可以與組織中的胺基形成共價席夫堿，這主要有助于組織的粘附。高明膠比(≥1:4)的粉狀水凝膠的粘接強度顯著高于粉狀(1:2)水凝膠(7.5kPa)。

粉末(1:4)水凝膠在模擬體內骨骼肌運動的各種變形條件下(彎曲和扭轉)表現出穩定的組織粘附性(圖4C)。此外，粉末(1:4)水凝膠即使在水中變形和水沖洗后仍保持穩定，表明在潮濕環境中具有良好的附著力和穩定性。因此，粉狀(1:4)水凝膠具有較強且穩定的組織粘附性，適合于VML骨骼肌再生。

1.4.dex-ald/明膠粉末水凝膠的細胞相容性

通過直接和間接接觸培養方式培養小鼠C2C12成肌細胞來評估粉末水凝膠的細胞相容性(圖5)。在這兩種培養方式下，用水凝膠培養的細胞在第1、2和3天的存活率都很高(>97%)，與在組織培養板(TCP)上培養的細胞沒有顯著差異(圖5A和B)。用WST-1法測定代謝活性3天，以研究粉末水凝膠對細胞增殖的影響(圖5C)。與對照組(TCP)相似，用粉末水凝膠培養的C2C12細胞在間接接觸和直接接觸兩種方式下均具有良好的增殖能力，且在培養過程中，粉末水凝膠組和TCP組的代謝活性無顯著差異。這些結果表明，我們的粉末水凝膠不會損害細胞活力或代謝活性。粉末水凝膠優異的細胞相容性可能與粉末水凝膠成分(明膠和葡聚糖)固有的生物相容性有關。

1.5.dex-ald/明膠粉末水凝膠的體內粘附性、止血性和可降解性

我們通過檢查dex-ald/明膠粉末水凝膠的組織粘連性、止血能力和可降解性來檢驗其作為組織粘連性水凝膠在體內應用的可行性。水凝膠的適當組織粘附對于提供受動態運動的組織(如骨骼肌)之間的可靠連接以及穩定地支持組織再生非常重要。我們研究了粉末(1:4)水凝膠和各種對照(預成型水凝膠、原位成型水凝膠和商業纖維蛋白膠)的體內組織粘附性，并比較了它們的特性(圖6)。注意，預成型和原位成型水凝膠與粉末水凝膠的組成相同。我們使用各種器官評估水凝膠樣品，包括出血器官(例如，VML損傷的出血性小鼠TA肌和出血性大鼠心臟)和非出血器官(大鼠肝臟、胃和腸)。每個水凝膠都受到水濺在器官上，以評估其附著力和穩定性。在VML損傷的出血性TA肌中，粉末水凝膠和纖維蛋白膠保持穩定，與損傷部位粘附良好(圖6B和C)。相比之下，在相同條件下，預形成和原位形成的水凝膠很容易脫落。特別是，預先形成的水凝膠不粘附在任何器官上。原位形成的水凝膠僅粘附在非出血器官上(圖6C)。結果表明，這些類型的水凝膠(預成型水凝膠和原位成型水凝膠)不適合治療無敷料或縫合的傷口。纖維蛋白膠穩定粘附在出血器官上;然而，它與肝臟的粘附不穩定，可能是因為它的表面光滑。相反，粉末水凝膠粘附在所有器官上，包括出血的VML和心臟。我們的粉末水凝膠具有優異的組織黏附性，這是因為干燥的dexald/明膠粉末可以吸收傷口的界面生物液體或血液，并有效地與組織相互作用。

止血對骨骼肌再生很重要。止血材料可以促進骨骼肌的再生，這種止血材料可以快速吸收血液，富集凝血因子，增強組織粘連，并對受傷肌肉進行物理保護。在我們的研究中，使用小鼠出血性肝模型評估了纖維蛋白膠、預成型水凝膠、原位成型水凝膠和dex-ald/明膠粉(1:4)的體內止血能力(圖6D和E)。未經任何治療(對照組)，大量失血量(220±35mg)。同樣，預先形成的水凝膠治療也沒有減少失血量(157±20mg)。纖維蛋白膠組(65±8mg)和原位形成的水凝膠組(80±21mg)的失血量顯著減少。重要的是，粉末水凝膠組的失血量最低(14±4mg)，證實了dex-ald/明膠粉末具有良好的止血能力，有利于傷口愈合。

1.6.利用dex-ald/明膠粉末水凝膠進行體內骨骼肌再生

通過VML和水凝膠處理后1周和3周的TA肌肉組織學分析，檢測dex-ald/明膠粉(1:4)水凝膠對VML損傷后骨骼肌再生的功效(圖7A)。我們包括未治療組和纖維蛋白膠治療組作為對照。粉末凝膠組在1周和3周時發現明顯的再生組織覆蓋缺損，比未處理組和纖維蛋白膠組大(圖7B)。VML后TA肌中的中心核肌纖維主要作為肌肉再生的指標進行分析。1周和3周時，粉末水凝膠組再生肌纖維面積明顯高于纖維蛋白膠組和未處理組(圖7C)。例如，1周時，未處理組、纖維蛋白膠組和粉末水凝膠組損傷區域內再生肌纖維的平均面積分別為209±23、237±14和304±39μm2;3周時，未處理組、纖維蛋白膠組和粉末水凝膠組的再生肌纖維面積分別為438±80、468±58和703±127μm2。第1周和第3周再生肌纖維區域的分布表明，粉末水凝膠組的大纖維數量多于未處理組和纖維蛋白膠組(圖7D)。這些結果表明，粉末水凝膠對VML損傷后肌肉再生有顯著促進作用。通過分析馬松三色染色圖像中的膠原沉積來評估瘢痕組織的形成(圖7E)。與其他組相比，粉末凝膠組TA肌力的恢復最大，而纖維蛋白膠處理也比未處理的對照組促進了肌力的恢復。例如，未治療組、纖維蛋白膠組和粉末膠組的肌力恢復率分別為38.2±5.5%、53.6±11.0%和89.0±5.5%。這種功能性肌肉力量恢復的改善與組織學評估中觀察到的趨勢(例如，有核肌纖維區域)密切相關。

肌肉再生不足或不適當通常伴隨著病理性組織重塑和纖維化。VML損傷治療1周后，粉末水凝膠組的纖維化面積較未治療組明顯縮小(圖7F)。3周后，各組纖維化面積均減小，且纖維化面積均小于對照組。如未治療組、纖維蛋白膠組、粉末水凝膠組3周纖維化面積分別為26.3±3.5%、24.5±2.9%、18.9±2.4%。上述結果表明，粉末水凝膠處理具有較強的組織粘連性和機械支持作用，可顯著促進VML損傷后骨骼肌再生，瘢痕組織減少。

除了提供充足的氧氣和營養物質外，血管化還可以激活常駐衛星細胞，促進肌肉祖細胞向損傷部位遷移以進行肌肉再生。因此，在樣本處理的肌肉組織血管化分析，以評估骨骼肌再生。治療1周后，與未治療組相比，粉末水凝膠組損傷組織中新血管形成增加(圖8A)。3周后，各組血管形成進一步增強，粉狀水凝膠組血管形成高于未處理組和纖維蛋白膠組。此外，由于巨噬細胞在炎癥中起關鍵作用，我們通過組織巨噬細胞的免疫染色檢查了損傷部位的炎癥組織反應。巨噬細胞可以誘導或消除炎癥，這取決于它們的微環境。巨噬細胞分化為炎癥型(M1)或抗炎型(M2)。過多的炎性巨噬細胞會放大炎癥并誘導瘢痕組織形成。在我們的研究中，表型VML損傷部位的巨噬細胞通過F4/80(一種泛巨噬細胞標記物)和CD206(一種抗原)雙重染色進行評估抗炎巨噬細胞標記)(圖8B)。治療1周后，粉水凝膠組F4/80(+)/CD206(+)細胞出現頻率明顯高于其他組。抗炎(M2)巨噬細胞可促進成肌細胞生長和分化，促進骨骼肌再生?？傊勰┧z治療促進了血管生成和抗炎組織反應，從而改善了骨骼肌再生，減少了疤痕組織。

結論

我們成功地開發了濕粘粉，它可以吸收傷口界面的水，并形成具有強組織粘附力的水凝膠，使用生物相容性和可生物降解的凝膠和明膠。由1:4(dex-ald:明膠)比例組成的dex-ald/明膠粉末顯示出有利于骨骼肌再生的特性，例如即使在潮濕環境中也能與傷口部位強粘附，具有機械支撐、止血和可降解性。粉末水凝膠顯著改善骨骼肌再生，減少瘢痕組織形成。免疫組織學分析顯示，粉末水凝膠可誘導VML損傷骨骼肌血管生成和抗炎巨噬細胞極化?？偟膩碚f，我們的dex-ald/明膠粉末水凝膠在促進VML損傷骨骼肌再生方面表現出顯著的功效，將為開發基于生物材料的各種組織再生策略提供一個有前景的平臺。

原文信息

The title of the article is “Wet tissue adhesive polymeric powder hydrogels for skeletal muscle regeneration”,

DOI: 10.1016/j.bioactmat.2024.06.017