1、分析方法驗(yàn)證是什么?

分析方法是指進(jìn)行分析檢測(cè)操作的方式。分析方法應(yīng)足夠詳細(xì)地描述每個(gè)分析檢測(cè)所必需的步驟。分析方法驗(yàn)證(Analytical Method Validation )的目的是證明建立的分析方法適合于相應(yīng)檢測(cè)要求。

 

2、分析方法驗(yàn)證的法規(guī)要求?

中國GMP

第十二條  質(zhì)量控制的基本要求：

 

（四）檢驗(yàn)方法應(yīng)當(dāng)經(jīng)過驗(yàn)證或確認(rèn)。

 

第一百四十二條  當(dāng)影響產(chǎn)品質(zhì)量的主要因素，如原輔料、與藥品直 接接觸的包裝材料、生產(chǎn)設(shè)備、生產(chǎn)環(huán)境（或廠房）、生產(chǎn)工藝、檢驗(yàn)方法 等發(fā)生變更時(shí)，應(yīng)當(dāng)進(jìn)行確認(rèn)或驗(yàn)證。必要時(shí)，還應(yīng)當(dāng)經(jīng)藥品監(jiān)督管理部門批準(zhǔn)。

 

第二百二十三條  物料和不同生產(chǎn)階段產(chǎn)品的檢驗(yàn)應(yīng)當(dāng)至少符合以下要求：

 

（一）企業(yè)應(yīng)當(dāng)確保藥品按照注冊(cè)批準(zhǔn)的方法進(jìn)行全項(xiàng)檢驗(yàn)；

 

（二）符合下列情形之一的，應(yīng)當(dāng)對(duì)檢驗(yàn)方法進(jìn)行驗(yàn)證：

 

采用新的檢驗(yàn)方法；

 

檢驗(yàn)方法需變更的：

 

3. 采用《中華人民共和國藥典》及其他法定標(biāo)準(zhǔn)未收載的檢驗(yàn)方法；

 

4. 法規(guī)規(guī)定的其他需要驗(yàn)證的檢驗(yàn)方法

 

（三）對(duì)不需要進(jìn)行驗(yàn)證的檢驗(yàn)方法,企業(yè)應(yīng)當(dāng)對(duì)檢驗(yàn)方法進(jìn)行確認(rèn),以確保檢驗(yàn)數(shù)據(jù)準(zhǔn)確、可靠。

 

第二百三十條  產(chǎn)品的放行應(yīng)當(dāng)至少符合以下第求：

 

（一）在批準(zhǔn)放行前,應(yīng)當(dāng)對(duì)每批藥品進(jìn)行質(zhì)量評(píng)價(jià)，保證藥品及其生產(chǎn)應(yīng)當(dāng)符合注冊(cè)和本規(guī)范要求,并確認(rèn)以下各項(xiàng)內(nèi)容：

 

1.主要生產(chǎn)工藝和檢驗(yàn)方法經(jīng)過驗(yàn)證。

國內(nèi)外分析方法驗(yàn)證指南

 

 

 

3、什么時(shí)候需要分析方法驗(yàn)證？

在建立藥品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)、變更藥品生產(chǎn)工藝或制劑組分、修訂原分析方法時(shí)，需對(duì)分析方法進(jìn)行驗(yàn)證。

 

4、分析方法驗(yàn)證的流程是什么？

 

 

驗(yàn)證的分析項(xiàng)目和驗(yàn)證指標(biāo)有哪些？

驗(yàn)證的指標(biāo)有：專屬性、準(zhǔn)確度、精密度（包括重復(fù)性、中間精密度和重現(xiàn)性）、檢測(cè)限、定量限、線性、范圍和耐用性。在分析方法驗(yàn)證中，須用標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)進(jìn)行試驗(yàn)。

由于分析方法具有各自的特點(diǎn)，并隨分析對(duì)象而變化，因此需要視具體情況擬訂驗(yàn)證的指標(biāo)。表1中列出的分析項(xiàng)目和相應(yīng)的驗(yàn)證指標(biāo)可供參考。

表1　檢驗(yàn)項(xiàng)目和驗(yàn)證指標(biāo)

 

①已有重現(xiàn)性驗(yàn)證，不需驗(yàn)證中間精密度。②如一種方法不夠?qū)?，可用其他分析方法予以補(bǔ)充。③視具體情況予以驗(yàn)證。

 

6、分析方法驗(yàn)證的內(nèi)容有哪些？

一、專屬性

專屬性系指在其他成分（如雜質(zhì)、降解產(chǎn)物、輔料等）可能存在下，采用的分析方法能正確測(cè)定出被測(cè)物的能力。鑒別反應(yīng)、雜質(zhì)檢査和含量測(cè)定方法，均應(yīng)考察其專屬性。如方法專屬性不強(qiáng)，應(yīng)采用一種或多種不同原理的方法予以補(bǔ)充。

 

1. 鑒別反應(yīng)

 

應(yīng)能區(qū)分可能共存的物質(zhì)或結(jié)構(gòu)相似的化合物。不含被測(cè)成分的供試品，以及結(jié)構(gòu)相似或組分中的有關(guān)化合物，應(yīng)均呈陰性反應(yīng)。

2. 含量測(cè)定和雜質(zhì)測(cè)定

 

采用的色譜法和其他分離方法，應(yīng)附代表性圖譜，以說明方法的專屬性，并應(yīng)標(biāo)明諸成分在圖中的位置，色譜法中的分離度應(yīng)符合要求。

在雜質(zhì)對(duì)照品可獲得的情況下，對(duì)于含量測(cè)定，試樣中可加入雜質(zhì)或輔料，考察測(cè)定結(jié)果是否受干擾，并可與未加雜質(zhì)或輔料的試樣比較測(cè)定結(jié)果。對(duì)于雜質(zhì)檢查，也可向試樣中加入一定量的雜質(zhì)，考察雜質(zhì)之間能否得到分離。

在雜質(zhì)或降解產(chǎn)物不能獲得的情況下，可將含有雜質(zhì)或降解產(chǎn)物的試樣進(jìn)行測(cè)定，與另一個(gè)經(jīng)驗(yàn)證的方法或藥典方法比較結(jié)果。也可用強(qiáng)光照射、高溫、高濕、酸（堿）水解或氧化的方法進(jìn)行強(qiáng)制破壞，以研究可能的降解產(chǎn)物和降解途徑對(duì)含量測(cè)定和雜質(zhì)測(cè)定的影響。

含量測(cè)定方法應(yīng)比對(duì)兩種方法的結(jié)果，雜質(zhì)檢査應(yīng)比對(duì)檢出的雜質(zhì)個(gè)數(shù)，必要時(shí)可采用光電二極管陣列檢測(cè)和質(zhì)譜檢測(cè)，進(jìn)行峰純度檢查。

 

二、準(zhǔn)確度

準(zhǔn)確度系指用所建立方法測(cè)定的結(jié)果與真實(shí)值或參比值接近的程度，一般用回收率（%）表示。準(zhǔn)確度應(yīng)在規(guī)定的線性范圍內(nèi)試驗(yàn)。準(zhǔn)確度也可由所測(cè)定的精密度、線性和專屬性推算出來。

 

在規(guī)定范圍內(nèi)，取同一濃度（相當(dāng)于100%濃度水平）的供試品，用至少6份樣品的測(cè)定結(jié)果進(jìn)行評(píng)價(jià)；或設(shè)計(jì)至少3種不同濃度，每種濃度分別制備至少3份供試品溶液進(jìn)行測(cè)定，用至少9份樣品的測(cè)定結(jié)果進(jìn)行評(píng)價(jià)，且濃度的設(shè)定應(yīng)考慮樣品的濃度范圍。兩種方法的選定應(yīng)考慮分析的目的和樣品的濃度范圍。

 

1. 化學(xué)藥含量測(cè)定方法的準(zhǔn)確度

原料藥可用已知純度的對(duì)照品或供試品進(jìn)行測(cè)定，或用所測(cè)定結(jié)果與已知準(zhǔn)確度的另一個(gè)方法測(cè)定的結(jié)果進(jìn)行比較。制劑可在處方量空白輔料中，加入已知量被測(cè)物對(duì)照品進(jìn)行測(cè)定。如不能得到制劑輔料的全部組分，可向待測(cè)制劑中加入已知量的被測(cè)物進(jìn)行測(cè)定，或用所建立方法的測(cè)定結(jié)果與已知準(zhǔn)確度的另一個(gè)方法測(cè)定結(jié)果進(jìn)行比較。

 

2. 化學(xué)藥雜質(zhì)定量測(cè)定的準(zhǔn)確度

可向原料藥或制劑中加入已知量雜質(zhì)對(duì)照品進(jìn)行測(cè)定。如不能得到雜質(zhì)對(duì)照品，可用所建立的方法與另一成熟方法（如藥典標(biāo)準(zhǔn)方法或經(jīng)過驗(yàn)證的方法）的測(cè)定結(jié)果進(jìn)行比較。

 

3. 中藥化學(xué)成分測(cè)定方法的準(zhǔn)確度

可用已知純度的對(duì)照品進(jìn)行加樣回收率測(cè)定，即向已知被測(cè)成分含量的供試品中再精密加入一定量的已知純度的被測(cè)成分對(duì)照品，依法測(cè)定。用實(shí)測(cè)值與供試品中含有量之差，除以加入對(duì)照品量計(jì)算回收率。

 

在加樣回收試驗(yàn)中須注意對(duì)照品的加入量與供試品中被測(cè)成分含有量之和必須在標(biāo)準(zhǔn)曲線線性范圍之內(nèi)；加入的對(duì)照品的量要適當(dāng)，過小則引起較大的相對(duì)誤差，過大則干擾成分相對(duì)減少，真實(shí)性差。

 

4. 數(shù)據(jù)要求

對(duì)于化學(xué)藥應(yīng)報(bào)告已知加入量的回收率（%），或測(cè)定結(jié)果平均值與真實(shí)值之差及其相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差或置信區(qū)間（置信度一般為95%）；對(duì)于中藥應(yīng)報(bào)告供試品取樣量、供試品中含有量、對(duì)照品加入量、測(cè)定結(jié)果和回收率（%）計(jì)算值，以及回收率（%）的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD%）或置信區(qū)間。

 

樣品中待測(cè)定成分含量和回收率限度關(guān)系可參考表2。在基質(zhì)復(fù)雜、組分含量低于0.01%及多成分等分析中，回收率限度可適當(dāng)放寬。

 

表2　樣品中待測(cè)定成分含量和回收率限度

 

此表源自AOAC《Guidelines for Single Laboratory Validation of Chemical Methods for Dietary Supplements and Botanicals》。

 

三、精密度

精密度系指在規(guī)定的測(cè)定條件下，同一份均勻供試品，經(jīng)多次取樣測(cè)定所得結(jié)果之間的接近程度。精密度一般用偏差、標(biāo)準(zhǔn)偏差或相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差表示。

在相同條件下，由同一個(gè)分析人員測(cè)定所得結(jié)果的精密度稱為重復(fù)性；在同一實(shí)驗(yàn)室內(nèi)的條件改變，如不同時(shí)間、不同分析人員、不同設(shè)備等測(cè)定結(jié)果之間的精密度，稱為中間精密度；不同實(shí)驗(yàn)室測(cè)定結(jié)果之間的精密度，稱為重現(xiàn)性。

 

含量測(cè)定和雜質(zhì)的定量測(cè)定應(yīng)考察方法的精密度。

 

1. 重復(fù)性

在規(guī)定范圍內(nèi)，取同一濃度（分析方法擬定的樣品測(cè)定濃度，相當(dāng)于100%濃度水平）的供試品，用至少6份的測(cè)定結(jié)果進(jìn)行評(píng)價(jià)；或設(shè)計(jì)至少3種不同濃度，每種濃度分別制備至少3份供試品溶液進(jìn)行測(cè)定，用至少9份樣品的測(cè)定結(jié)果進(jìn)行評(píng)價(jià)。采用至少9份測(cè)定結(jié)果進(jìn)行評(píng)價(jià)時(shí)，濃度的設(shè)定應(yīng)考慮樣品的濃度范圍。

 

2. 中間精密度

考察隨機(jī)變動(dòng)因素，如不同日期、不同分析人員、不同儀器對(duì)精密度的影響，應(yīng)進(jìn)行中間精密度試驗(yàn)。

 

3. 重現(xiàn)性

國家藥品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)采用的分析方法，應(yīng)進(jìn)行重現(xiàn)性試驗(yàn)，如通過不同實(shí)驗(yàn)室協(xié)同檢驗(yàn)獲得重現(xiàn)性結(jié)果。

 

協(xié)同檢驗(yàn)的目的、過程和重現(xiàn)性結(jié)果均應(yīng)記載在起草說明中。應(yīng)注意重現(xiàn)性試驗(yàn)所用樣品質(zhì)量的一致性及貯存運(yùn)輸中的環(huán)境對(duì)該一致性的影響，以免影響重現(xiàn)性試驗(yàn)結(jié)果。

 

4. 數(shù)據(jù)要求

均應(yīng)報(bào)告標(biāo)準(zhǔn)偏差、相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差或置信區(qū)間。樣品中待測(cè)定成分含量和精密度RSD可接受范圍參考表3（可接受范圍可在給出數(shù)值0.5～2倍區(qū)間，計(jì)算公式，重復(fù)性：RSDr=C-0.15；重現(xiàn)性：RSDR=2C-0.15，其中C為待測(cè)定成分含量）。在基質(zhì)復(fù)雜、組分含量低于0.01%及多成分等分析中，精密度限度可適當(dāng)放寬。

表3　樣品中待測(cè)定成分的含量與精密度可接受范圍關(guān)系

此表源自AOAC《Guidelines for Single Laboratory Validation of Chemical Methods for Dietary Supplements and Botanicals》。

 

四、檢測(cè)限

檢測(cè)限系指試樣中被測(cè)物能被檢測(cè)出的最低量。檢測(cè)限僅作為限度試驗(yàn)指標(biāo)和定性鑒別的依據(jù)，沒有定量意義。常用的方法如下。

1. 直觀法

用已知濃度的被測(cè)物，試驗(yàn)出能被可靠地檢測(cè)出的最低濃度或量。

2. 信噪比法

用于能顯示基線噪聲的分析方法，即把已知低濃度試樣測(cè)出的信號(hào)與空白樣品測(cè)出的信號(hào)進(jìn)行比較，計(jì)算出能被可靠地檢測(cè)出的被測(cè)物質(zhì)最低濃度或量。一般以信噪比為3∶1時(shí)相應(yīng)濃度或注入儀器的量確定檢測(cè)限。

3. 基于響應(yīng)值標(biāo)準(zhǔn)偏差和標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率法

按照LOD=3.3δ/S公式計(jì)算。式中LOD：檢測(cè)限；δ：響應(yīng)值的偏差；S：標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率。

δ可以通過下列方法測(cè)得：①測(cè)定空白值的標(biāo)準(zhǔn)偏差；②標(biāo)準(zhǔn)曲線的剩余標(biāo)準(zhǔn)偏差或是截距的標(biāo)準(zhǔn)偏差。

4. 數(shù)據(jù)要求

上述計(jì)算方法獲得的檢測(cè)限數(shù)據(jù)須用含量相近的樣品進(jìn)行驗(yàn)證。應(yīng)附測(cè)定圖譜，說明試驗(yàn)過程和檢測(cè)限結(jié)果。

五、定量限

定量限系指試樣中被測(cè)物能被定量測(cè)定的最低量，其測(cè)定結(jié)果應(yīng)符合準(zhǔn)確度和精密度要求。對(duì)微量或痕量藥物分析、定量測(cè)定藥物雜質(zhì)和降解產(chǎn)物時(shí)，應(yīng)確定方法的定量限。常用的方法如下。

1. 直觀法

用已知濃度的被測(cè)物，試驗(yàn)出能被可靠地定量測(cè)定的最低濃度或量。

2. 信噪比法

用于能顯示基線噪聲的分析方法，即將已知低濃度試樣測(cè)出的信號(hào)與空白樣品測(cè)出的信號(hào)進(jìn)行比較，計(jì)算出能被可靠地定量的被測(cè)物質(zhì)的最低濃度或量。一般以信噪比為10∶1時(shí)相應(yīng)濃度或注入儀器的量確定定量限。

3. 基于響應(yīng)值標(biāo)準(zhǔn)偏差和標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率法

按照LOQ=10δ/S公式計(jì)算。式中LOQ：定量限；δ：響應(yīng)值的偏差；S：標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率。

δ可以通過下列方法測(cè)得：①測(cè)定空白值的標(biāo)準(zhǔn)偏差；②采用標(biāo)準(zhǔn)曲線的剩余標(biāo)準(zhǔn)偏差或是截距的標(biāo)準(zhǔn)偏差。

4. 數(shù)據(jù)要求

上述計(jì)算方法獲得的定量限數(shù)據(jù)須用含量相近的樣品進(jìn)行驗(yàn)證。應(yīng)附測(cè)試圖譜，說明測(cè)試過程和定量限結(jié)果，包括準(zhǔn)確度和精密度驗(yàn)證數(shù)據(jù)。

六、線性

線性系指在設(shè)計(jì)的范圍內(nèi)，線性試驗(yàn)結(jié)果與試樣中被測(cè)物濃度直接呈比例關(guān)系的能力。

應(yīng)在設(shè)計(jì)的范圍內(nèi)測(cè)定線性關(guān)系?？捎猛粚?duì)照品貯備液經(jīng)精密稀釋，或分別精密稱取對(duì)照品，制備一系列對(duì)照品溶液的方法進(jìn)行測(cè)定，至少制備5個(gè)不同濃度水平。以測(cè)得的響應(yīng)信號(hào)作為被測(cè)物濃度的函數(shù)作圖，觀察是否呈線性，再用最小二乘法進(jìn)行線性回歸。必要時(shí)，響應(yīng)信號(hào)可經(jīng)數(shù)學(xué)轉(zhuǎn)換，再進(jìn)行線性回歸計(jì)算，或者可采用描述濃度-響應(yīng)關(guān)系的非線性模型。

數(shù)據(jù)要求：應(yīng)列出回歸方程、相關(guān)系數(shù)、殘差平方和、線性圖（或其他數(shù)學(xué)模型）。

七、范圍

范圍系指分析方法能達(dá)到精密度、準(zhǔn)確度和線性要求時(shí)的高低限濃度或量的區(qū)間。

范圍應(yīng)根據(jù)分析方法的具體應(yīng)用及其線性、準(zhǔn)確度、精密度結(jié)果和要求確定。

原料藥和制劑含量測(cè)定，范圍一般為測(cè)定濃度的80%～120%；制劑含量均勻度檢査，范圍一般為測(cè)定濃度的70%～130%，特殊劑型，如氣霧劑和噴霧劑，范圍可適當(dāng)放寬；溶出度或釋放度中的溶出量測(cè)定，范圍一般為限度的±30%，如規(guī)定了限度范圍，則應(yīng)為下限的-20%至上限的+20%；雜質(zhì)測(cè)定，范圍應(yīng)根據(jù)初步實(shí)際測(cè)定數(shù)據(jù)，擬訂為規(guī)定限度的±20%。

如果一個(gè)試驗(yàn)同時(shí)進(jìn)行含量測(cè)定和純度檢查，且僅使用100%的對(duì)照品，線性范圍應(yīng)覆蓋雜質(zhì)的報(bào)告水平至規(guī)定含量的120%。

在中藥分析中，范圍應(yīng)根據(jù)分析方法的具體應(yīng)用和線性、準(zhǔn)確度、精密度結(jié)果及要求確定。對(duì)于有毒的、具特殊功效或藥理作用的成分，其驗(yàn)證范圍應(yīng)大于被限定含量的區(qū)間。溶出度或釋放度中的溶出量測(cè)定，范圍一般為限度的±30%。

八、耐用性

耐用性系指在測(cè)定條件有小的變動(dòng)時(shí)，測(cè)定結(jié)果不受影響的承受程度，為所建立的方法用于常規(guī)檢驗(yàn)提供依據(jù)。開始研究分析方法時(shí)，就應(yīng)考慮其耐用性。

如果測(cè)試條件要求苛刻，則應(yīng)在方法中寫明，并注明可以接受變動(dòng)的范圍，可以先采用均勻設(shè)計(jì)確定主要影響因素，再通過單因素分析等確定變動(dòng)范圍。

典型的變動(dòng)因素有被測(cè)溶液的穩(wěn)定性、樣品的提取次數(shù)、時(shí)間等。液相色譜法中典型的變動(dòng)因素有流動(dòng)相的組成和pH值、不同品牌或不同批號(hào)的同類型色譜柱、柱溫、流速等。氣相色譜法變動(dòng)因素有不同品牌或批號(hào)的色譜柱、不同類型的擔(dān)體、載氣流速、柱溫、進(jìn)樣口和檢測(cè)器溫度等。

經(jīng)試驗(yàn)，測(cè)定條件小的變動(dòng)應(yīng)能滿足系統(tǒng)適用性試驗(yàn)要求，以確保方法的可靠性。

 

7、如何制定方法驗(yàn)證的可接受標(biāo)準(zhǔn)?

某生物制藥企業(yè)分析方法驗(yàn)證的接受標(biāo)準(zhǔn)舉例，僅供參考學(xué)習(xí)：