摘要：截至2020年，文獻作者記錄了共有9款ADC藥物獲得商業化批準，而目前這一數字已上升至15款。這些藥物無一例外地采用了化學偶聯技術進行生產。在這些獲批的ADC中，有7種藥物因其廣泛的藥物分布特性而受到市場的關注。特別值得一提的是，2019年，第一三共成功將首款位點特異性ADC引入市場，標志著位點特異性偶聯技術在ADC領域的研究者中日益受到青睞。

本文重點討論了當前ADC生產的偶聯方法并對其中三種常用偶聯工藝進行了比較。

抗體偶聯藥物概述

抗體偶聯藥物 (ADC) 通常由四部分組成，包括單克隆抗體，細胞毒性有效載荷，連接子和偶聯位點。

單克隆抗體在ADC藥物的設計中扮演著關鍵角色，其對腫瘤相關抗原的高親和力為藥物提供了精確的靶向能力。與此同時，有效載荷的毒性殺傷作用是實現治療效果的另一大支柱。通過精心設計的連接子，單抗和有效載荷在適宜的偶聯位點相連，共同構成了一個高效且具有特定靶向性的ADC藥物。

連接子和偶聯化學在生產穩定且有效的ADC藥物中扮演著核心角色。一方面，偶聯位點的共價鍵必須具備足夠的穩定性，以確保ADC在形成后能夠保持穩定，并在治療過程中展現出良好的體內藥代動力學特性。另一方面，連接子在內化至靶細胞后，必須能夠有效地釋放其攜帶的有毒有效載荷，以實現對腫瘤細胞的精準殺傷。

藥物-抗體比例（DAR）是評估ADC藥物性能的一個關鍵指標，它對藥物的療效和安全性起著決定性作用。DAR值過高可能導致ADC在生產過程中出現聚集現象，并可能在體內的清除速度加快，從而降低治療效果。相反，DAR值過低的ADC可能面臨療效不足的問題，因為未偶聯或低藥物負載的抗體可能會與靶抗原發生競爭。不同的ADC對最佳DAR值的需求各異，因此，精確獲得和控制這一比例是ADC藥物開發企業必須掌握的關鍵能力。

有前景的偶聯方法既有利于生產臨床中有效安全的ADC藥物，也有利于建立精簡的ADC生產工藝，作者對已應用于大規模生產的偶聯方法進行了總結，重點強調高生產率，可放大和穩健的偶聯工藝。

表 1. FDA審批通過的ADC藥物 (該表截至原文獻作者2020年發文時的統計數據。目前已有15款ADC藥物上市，除了表中9款之外還有Rakuten Medical的Akalux，ADC Therapeutics的Zynlonta，榮昌生物的Akalux，Seagen/Genmab的Tivdak，ImmunoGen的Elahere；AstraZeneca的Lumoxiti于2018年FDA approve，2023年撤市) 

圖 1. (a) ADC各組成部分的要求, (b) ADC偶聯工藝的要求

偶聯方法分類

總體上ADC生產中的偶聯方法可以做如下分類：

第一類是天然賴氨酸偶聯或半胱氨酸偶聯。

第二類是抗體工程化技術通過在抗體分子中引入半胱氨酸殘基或非天然氨基酸殘基，為有效載荷的結合提供了特定位點的反應標簽。這種創新方法最初在2008年被報道，它使得ADC的開發能夠實現更高程度的位點特異性。目前，利用此技術開發的某些ADC藥物正在進行人體臨床試驗，展現出應用前景。然而，該方法也面臨一些挑戰，例如，合適的插入位點的選擇增加了早期ADC設計的復雜性，并可能在抗體的細胞培養和生產過程中引入額外的難題。

第三類是使用酶催化偶聯。利用酶催化的位點特異性修飾技術，可以精確地在抗體上引入所需的化學基團，從而生產出具有均一DAR值的ADC。這種技術能夠確保藥物分子與抗體的穩定且均勻的結合，提高ADC的療效和安全性。然而，這一方法也面臨著一些挑戰。首先，所使用的酶本身也是一種蛋白質，如果其物理化學性質與單克隆抗體相似，可能會在純化過程中引入額外的復雜性。其次，將酶作為生產過程中的關鍵原材料，需要制定全面的化學、制造和控制（CMC）策略，以確保生產過程的一致性和可重復性。

化學偶聯之隨機偶聯ADC

傳統的隨機化學偶聯方法基于使用抗體中天然存在的氨基酸殘基進行非選擇性修飾，例如天然賴氨酸 (圖2a) 和還原的鏈間天然半胱氨酸 (圖2b) 。

1.天然賴氨酸偶聯

偶聯工藝簡介：藥物-抗體比例（DAR）是評估ADC藥物性能的重要指標，它對藥物的療效和安全性起著決定性作用。DAR值過高可能導致ADC在生產過程中聚集，且在體內的清除速度加快，而DAR值過低則可能影響藥物的療效，因為未偶聯或低藥物負載的抗體可能與靶抗原發生競爭。不同的ADC可能具有不同的最佳DAR值，精確地獲得和控制這一最佳值是ADC藥物開發企業必須掌握的關鍵能力。

特點和缺陷：藥物-抗體比例（DAR）是評估ADC藥效和安全性的重要指標。DAR值過高可能導致ADC在體內聚集并加快清除速率；而DAR值過低可能影響藥物的療效，因為未偶聯或低藥物負載的抗體可能與靶抗原發生競爭。不同的ADC可能具有不同的最佳DAR值，因此，精確獲得和控制這一最佳值是ADC開發企業必須掌握的關鍵能力。對于通過天然賴氨酸殘基進行偶聯的ADC，由于天然IgG1分子具有約80個賴氨酸殘基，合成的ADC是具有不同DAR值的混合物。例如，T-DM1（Kadcyla）就是這種情況。因此，利用天然賴氨酸進行偶聯需要付出巨大努力，以建立一個能夠重復生產具有一致有效載荷分布和DAR值的穩健生產工藝。

2.天然半胱氨酸偶聯

偶聯工藝簡介：藥物-抗體比例（DAR）是評估ADC藥物性能的重要指標，其值的高低對藥物的療效和安全性具有顯著影響。DAR值過高可能導致ADC在生產過程中出現聚集現象，且在體內的清除速率加快，而DAR值過低則可能影響藥物的療效，因為未偶聯或低藥物負載的抗體可能會與靶抗原發生競爭。不同的ADC藥物對最佳DAR值的需求各異，因此，精確獲得和控制這一最佳值是ADC藥物開發企業必須掌握的關鍵能力。

特點和缺陷：與通過賴氨酸殘基進行偶聯的方法相比，天然半胱氨酸偶聯的ADC展現出了更為可控的DAR值和較低的產品異質性，盡管實現精確的DAR值仍面臨挑戰。因此，這種方法已成為當前ADC合成的主流技術。然而，該技術仍需進一步優化。例如，使用三（2-羧乙基）膦（TCEP）進行還原時，若在37℃下未進行適當優化，可能會導致產品出現渾濁和聚集現象。此外，抗體的反應活性與其等電點（pI）密切相關，這使得建立一個普適的金標準變得復雜。

圖 2. (a) T-DM1的合成工藝, (b) Trastuzumab-MMAE的合成工藝

化學偶聯之位點特異性偶聯ADC

近年來，眾多科學家投身于生物相容性生產技術的研究，目的是制造出位點特異性ADC，這被認為能夠顯著增強藥物的臨床治療窗口。盡管這一領域取得了顯著進展，但只有少數技術成功跨越了從實驗室研究到工藝開發和規模化生產的鴻溝。

1.高DAR值ADC

盡管高DAR值的ADC可能展現出對癌細胞更強的殺傷力，但它們的藥代動力學特性和全身性暴露往往不盡如人意。例如，高DAR值的ADC可能更容易被免疫系統清除，或者由于更強的疏水性而傾向于聚集。為了克服這些障礙，研究人員正在探索額外的技術來生產位點特異性的高DAR值ADC，如通過引入親水性連接子來改善其物理化學和生物特性。

案例一：第一三共的突破性藥物Enhertu采用了一種創新的藥物-連接子結構設計，以解決傳統抗體藥物偶聯物（ADC）在DAR8狀態下常遇到的疏水性挑戰。該藥物利用依沙替康衍生物作為有效載荷，并通過一種四肽（GGFG）連接子與靶向抗體穩定連接。此連接子在血液循環中具有高度穩定性，并能在ADC靶向至腫瘤后被特定的酶精確裂解，從而增強了ADC的穩定性并提高了治療效率。

案例二：Trodelvy，由吉利德公司開發的一種高效ADC，通過其每個Trop-2抗體連接多達8個SN38分子，實現了高DAR值。該藥物的連接子由七個短鏈的親水性PEG單元構成，這種設計不僅減少了ADC制備過程中的聚集趨勢，還提升了藥物的溶解性和穩定性。一旦ADC被細胞內化，連接子中的碳酸酯鍵在細胞內的酸性pH條件下迅速裂解，釋放出SN-38，從而在腫瘤細胞內發揮其細胞毒性效應。

圖 3. sacituzumab govitecan-hziy的合成工藝

2.天然半胱氨酸重橋接

半胱氨酸重橋接是一個兩步過程，利用一組串聯的Michael/Retro-Michael反應將天然抗體轉變為位點特異性ADC(圖 4)。

盡管高DAR值的ADC可能展現出更強的癌細胞殺傷力，但其藥代動力學特性和全身性暴露往往不盡如人意。例如，高DAR值的ADC可能更容易被免疫系統清除，或者由于更強的疏水性而傾向于聚集。為了克服這些挑戰，研究人員正在開發能夠生產位點特異性高DAR值ADC的額外技術，如引入親水性連接子以改善其物理和生物特性。

位點特異性ADC的開發提供了一種生產具有低異質性DAR4的ADC的方法，這些ADC具有改善的物理和生物特性，得益于合適的親水間隔物的引入。該轉化過程從完整抗體到ADC的效率高，范圍在70-95%之間。所需的試劑為小分子量的還原劑和帶有親水間隔物的藥物接頭，這些試劑可以通過切向流過濾（TFF）輕松去除，簡化了偶聯和純化過程。

橋接位點特異性方法因其簡單性和高效性而在化學文獻中得到了廣泛報道。特別是在抗體的位點特異性偶聯反應中，有效的雙烷基化試劑，如溴亞甲基吡咯酮、二硫代馬來酰亞胺、二溴吡嗪二酮或芳基二丙腈等，已被證明能夠提高偶聯效率。這些試劑的使用也表明ADC的DAR值是可控的，可以根據需要調節。

圖 4. 基于半胱氨酸重橋接的trastuzumab-MMAE合成工藝

3. Fc親和肽結合

蛋白A，一種源自細菌的小分子蛋白，因其對抗體的特異性親和力而受到研究者的青睞。基于這一特性，研究者通過改造獲得了具有更高親和力的肽段，例如對Z結構域的改造，以及被稱為Fc III的17個氨基酸殘基的肽段，后者能夠特異性地結合人IgG1的Fc片段。利用這些親和化合物進行化學偶聯，即親和標記，已成為實現位點特異性修飾的有前景的方法之一。

Ajinomoto公司開發了一種創新的肽基試劑，該試劑含有可裂解的連接子，并將其應用于一種先進的無痕標記技術，命名為AJICAP®。通過這項技術，公司成功地證明了其位點特異性ADC在動物模型中展現出顯著的療效（參見圖5）。合成策略包括將含有活性酯的親和肽試劑特異性地與曲妥珠單抗的Fc區域Lys 248位點結合，形成曲妥珠單抗與肽的共軛物。隨后，通過還原切割抗體與肽之間的二硫鍵連接物，并利用DHAA進行再氧化，以生成含有硫醇的抗體。最終，這些硫醇基團與商業化的MC-VC-MMAE進行反應，成功合成了AJICAP®-ADC。

這種稱為第一代AJICAP®的 ADC 生產工藝由一個簡單的程序組成，其中包含一個TFF純化步驟，而無需引入制備色譜進行純化。

圖 5. 基于第一代AJICAP的trastuzumab-MMAE合成工藝

三種化學偶聯工藝的優缺點比較

作者對三種化學定點偶聯方法進行了優缺點比較。

高DAR值偶聯：此技術展現出在制造穩定性和生產歷史方面的明顯優勢，其已被應用于市售ADC藥物的制造，并且通過細致的調整和優化，有望擴展至其他ADC產品的生產。盡管如此，所期望的藥物-抗體比率（DAR）與藥物連接子的相容性可能會面臨挑戰。以傳統的藥物連接子MC-VC-MMAE為例，如果不進行結構上的重新設計和改進，其高疏水性可能導致分子聚集，從而阻礙實現高DAR值的偶聯。此外，高DAR值的ADC可能僅通過較弱的非共價鍵連接其重鏈和輕鏈，這可能構成一個潛在的缺陷。連接區域缺乏二硫鍵可能對ADC的物理化學特性產生不利影響，已有研究指出，例如sacituzumab govitecan-hziy，其抗體依賴性細胞介導的細胞毒性（ADCC）活性顯著降低。

天然半胱氨酸重橋接：此技術在偶聯條件上展示了卓越的適應性，通過簡單地更換雙烷基化試劑，便能輕松調節所需的藥物-抗體比率（DAR）。與傳統的硫醇-馬來酰亞胺化學偶聯相比，半胱氨酸重橋接避免了逆邁克爾反應的風險，后者可能導致連接子-有效載荷在血液循環中過早釋放，引發不利的生物效應。然而，半胱氨酸重橋接技術也存在潛在的缺陷，即可能形成一些非預期的“錯誤橋接”ADC。不過，通過采用創新的雙烷基化試劑和優化的偶聯工藝，這一問題有望得到有效解決。

Fc親和肽結合：Fc親和肽技術展現出了在多種抗體和藥物接頭應用中的巨大潛力。與傳統方法相比，此技術能夠實現位點特異性的DAR2 ADC，無需依賴于親水性連接子或雙烷基化試劑。盡管該技術在合成過程中需要較長的步驟，但近期Ajinomoto公司的研究人員通過工藝優化，有望克服這一挑戰。

表 2. 三種化學位點特異性偶聯方法的比較

未來發展方向

位點特異性偶聯：相較于傳統的高異質性隨機偶聯ADC，位點特異性ADC和具有均勻DAR值的ADC在組成和分析上展現出了更高的簡便性，預示著其市場需求將不斷增長。

偶聯后純化方法：為了滿足對特定DAR值ADC的特定需求，可能需要采用色譜純化技術來分離具有特定DAR值的ADC組分。目前，可擴展的高效離子交換色譜-高效液相色譜（HIC-HPLC）純化方法正在積極開發中，并且已經識別出適合藥物接頭疏水性的合適樹脂材料。同時，提高純化過程中的回收率也是當前研究的一個重要焦點。

偶聯分子形式多樣化：未來ADC領域的發展趨勢將包括利用多樣化的分子形式，如雙特異性抗體和Fc融合蛋白等。然而，由于這些分子的復雜性，某些ADC構建體在生產過程中可能面臨穩定性的挑戰。因此，開發特定的偶聯條件以適應這些復雜結構的ADC構建體，將是實現其穩定生產的關鍵。

復雜分子提高對偶聯的要求：本綜述指出，目前廣泛采用的偶聯技術多依賴于TCEP介導的二硫鍵還原步驟。然而，面對下一代高度工程化的抗體，如對氧化還原狀態敏感的雙特異性抗體，現有方法可能面臨挑戰。因此，未來研究可能需探索不依賴于二硫鍵還原的位點特異性偶聯策略。這包括開發非共價結合的ADC技術、基于色氨酸或酪氨酸的選擇性偶聯方法，以及利用金屬催化進行抗體標記的新型反應。

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