摘 要： 建立液相色譜-串聯質譜法測定雞蛋、蝦、魚等農產品中硝基呋喃代謝物的殘留量。樣品中的硝基呋喃殘留物經鹽酸水解后，以2-硝基苯甲醛衍生，采用乙酸乙酯提取，濃縮，凈化后再用C18色譜柱分離，以0.1%甲酸水溶液-乙腈溶液作為流動相梯度洗脫，電噴霧離子源（ESI）下以多反應監測（MRM）正離子模式掃描檢測，內標法定量分析。呋喃它酮代謝物、呋喃西林代謝物、呋喃妥因代謝物、呋喃唑酮代謝物的質量濃度在0.5～50 ng/mL范圍內與色譜峰面積線性關系良好，相關系數均大于0.995，檢出限分別為0.13、0.035、0.14、0.017 μg/kg。在雞蛋、蝦、魚中添加2、5、10 μg/kg硝基呋喃代謝物時，平均回收率為88.71%～105.16 %，測定結果的相對標準偏差為3.12%～9.08%（n=6）。該方法簡便、快捷、準確度高，可用于測定雞蛋、蝦、魚等農副產品中的硝基呋喃代謝物。

 

關鍵詞： 硝基呋喃代謝物； 液相色譜-串聯質譜法； 衍生化； 雞蛋； 魚； 蝦

 

 

硝基呋喃類藥物主要包括呋喃它酮、呋喃西林、呋喃妥因、呋喃唑酮等，可抑制或殺滅多種革蘭氏菌以及某些真菌和原蟲，主要用于預防和治療腸道細菌感染，在畜牧業和水產養殖中得到廣泛應用[1?2]。由于硝基呋喃類藥物及其代謝物屬于硝基雜環類化合物，具有細胞誘變性和動物致癌毒性，已引起臨床高度重視。歐盟、日本和美國等大部分國家和地區已禁止呋喃西林等4 種硝基呋喃類藥物在肉類食品中的殘留，我國也在2002年將該類抗生素列為食源性動物禁止使用的藥物[3?4]。由于硝基呋喃類原型藥在生物體內代謝迅速，呋喃它酮、呋喃西林、呋喃妥因、呋喃唑酮在體內分別代謝為5甲基嗎啉-3-氨基-2-唑烷基酮(AMOZ)、氨基脲(SEM)、1-氨基-2-乙內酰(AHD)、3-氨基-2-惡唑烷酮(AOZ)，因此常通過檢測代謝物來反映硝基呋喃類藥物的殘留狀況[5?6]。

硝基呋喃類藥物檢測標準分類比較復雜，現行有效的國家檢測標準就有20個，如GB 31656.13— 2021《食品安全國家標準　水產品中硝基呋喃類代謝物多殘留的測定　液相色譜－串聯質譜法》、GB/T 21311—2007《動物源性食品中硝基呋喃類藥物代謝物殘留量檢測方法　高效液相色譜/串聯質譜法》、GB/T 20752—2006《豬肉、牛肉、雞肉、豬肝和水產品中硝基呋喃類代謝物殘留量的測定　液相色譜-串聯質譜法》 等。按照檢測儀器分類主要包括高效液相色譜法[7]、液相色譜-質譜法[8?13]、膠體金免疫層析法[14?15]、酶聯免疫吸附法[16]等，其中液相色譜串聯質譜(LC-MS/MS)法檢測雞蛋、水產品等報道最為常見。然而文獻報道或國家標準中，液相色譜串聯質譜法在檢測樣品時的分類處理較為復雜，不同類型樣品處理方法不一致，衍生化時間較長等問題，筆者嘗試建立可同時處理和檢測幾種不同基質樣品的方法，簡化樣品處理過程，統一檢測方法，為雞蛋、魚、蝦等不同食用農產品的監管與產品質量控制提供了更多的檢測方法與思路。

 

 

1、 實驗部分

 

 

1.1 主要儀器與試劑

液相色譜-質譜聯用儀：QQQ 4000+型，美國AB SCIEX公司；

超聲清洗儀：KQ-250DV型，昆山市超聲儀器有限公司。

超純水機：Milli-Q型，美國密理博公司。

有機系針筒式微孔濾膜：0.45 μm，上海安譜公司。

電子天平：XS205D型，感量為0.01 mg，瑞士梅特勒-托利多公司。

pH計：seven compact型，瑞士梅特勒-托利多公司。

往復式恒溫振蕩水浴培養搖床：SPH-100×24型，上海世平實驗設備有限公司。

高速離心機：Multifuge X pro型，美國賽默飛科技有限公司。

渦旋混合器：XW-80A型，上海馳唐電子有限公司。

高速分散機：T25型，德國艾卡公司。

水浴氮吹儀：JHD-006型，上海極恒實業有限公司。

不同量程移液器：德國艾本德公司。

2-硝基苯甲醛：優級純，上海阿拉丁生化科技股份有限公司。

鹽酸、氫氧化鈉、磷酸鉀：均為優級純，國藥集團化學試劑有限公司。

乙腈、甲醇、乙酸乙酯、正己烷：均為色譜級，德國默克公司。

甲酸：色譜級，上海易恩化學技術有限公司。

實驗用水均為超純水。

雞蛋、蝦、魚等樣品，市售。

AMOZ、SEM、AHD、AOZ混合標準溶液：各組分質量濃度均為100 mg/L，標準物質編號為S080813，天津阿爾塔科技有限公司。

D5-AMOZ、13C15 N-SEM、13C-AHD、D4-AOZ混合標準溶液：各組分質量濃度均為100 mg/L，標準物質編號為S087591，天津阿爾塔科技有限公司。

1.2 儀器工作條件

1.2.1 色譜儀

色譜柱：Waters ACQUITY UPLC BEH C18色譜柱(100 mm×2.1 mm，1.7 μm，美國沃特世公司)；流動相：A相為0.1%甲酸水溶液，B相為乙腈，流量為0.2 mL/min；柱溫：30 ℃；進樣體積：2 μL；洗脫方式：梯度洗脫；梯度洗脫程序：0～6.0 min，A相由90%降至40%，6.0～6.1 min，A相由40%升至90%，保持3.9 min。

1.2.2 質譜儀

離子源：電噴霧離子源(ESI)；掃描方式：正離子掃描；檢測方式：多反應監測(MRM)；離子源噴霧電壓：5 500 V；離子源加熱溫度：500 ℃；氣簾氣、霧化氣、輔助加熱氣、噴撞氣：均為氮氣，硝基呋喃類代謝物質譜參數見表1。

表1   硝基呋喃代謝物的質譜檢測參數

Tab. 1   Mass parameters of nitrofuran compounds

 

 

1.3 樣品處理

稱取雞蛋、蝦、魚等樣品各2 g，置于50 mL離心管中，加入0.2 mol/L鹽酸溶液10 mL，用均質器以10 000 r/min均質1 min，加入100 ng/mL混合內標溶液0.05 mL，再加入0.1 mol/L 2-硝基苯甲醛溶液100 μL，渦旋混合30 s后，置于37 ℃恒溫箱中反應2 h，取出離心管，冷卻至室溫，加入0.3 mol/L磷酸鉀溶液1 mL，用2.0 mol/L氫氧化鈉溶液調節pH為7.2～7.6，再加入10 mL乙酸乙酯振蕩10 min提取，再以8 000 r/min離心5 min，取乙酸乙酯層于40 ℃下用氮氣吹干，殘渣用0.1%甲酸水溶液1 mL 溶解，再用3 mL乙腈飽和的正己烷液液分離去除脂肪，下層水相過0.22 μm濾膜，用液相色譜-串聯質譜法測定。

1.4 溶液配制

混合標準儲備溶液：量取AMOZ、SEM、AHD、AOZ混合標準溶液0.1 mL，置于100 mL容量瓶中，用甲醇稀釋至標線，制成100 ng/mL的混合標準儲備溶液。

混合內標溶液：量取D5-AMOZ、13C15 N-SEM、13C-AHD、D4-AOZ混合標準溶液0.1 mL，置于100 mL容量瓶中，用甲醇稀釋制成100 ng/mL的混合內標溶液。

系列混合標準工作溶液：分別取混合標準儲備溶液0.005、0.01、0.02、0.05、0.1、0.2、0.5 mL，置于50 mL離心管中，加入混合內標溶液0.05 mL，制成質量濃度分別為0.5、1、2、5、10、20、50 ng/mL的系列混合標準工作溶液，質量濃度分別為0.5、1、2、5、10、20、50 ng/mL，內標物質質量濃度均為5 ng/mL。

1.5 實驗方法

將樣品溶液與系列混合標準工作溶液注入高效液相色譜-串聯質譜儀，在1.2儀器工作條件下檢測，建立各代謝物的線性方程并以內標法計算樣品中的化合物含量。

 

2、 結果與分析

 

2.1 樣品處理方法的優化

2.1.1 衍生化溫度的選擇

GB 31656.13—2021《水產品中硝基呋喃類代謝物多殘留的測定》、GB/T 21311—2007《動物源性食品中硝基呋喃類藥物代謝物殘留量檢測》、農業部783號公告-1-2006《水產品中硝基呋喃類代謝物殘留量的測定》等國家標準中樣品制備條件均為37 ℃衍生化16 h，耗時較長。首先考察衍生化16 h不同溫度(25、37、60 ℃)對衍生化效率的影響，不同溫度條件下硝基呋喃化合物的衍生化的效率如圖1所示，從圖1可以看出，衍生效率無顯著性差異。因此選擇37 ℃作為衍生化溫度。

圖1   不同溫度下硝基呋喃化合物的衍生化的效率

Fig. 1   The efficiency of derivatization of nitrofuran compounds in different temperatures

A—25 ℃；B—37 ℃ C—60 ℃

 

2.1.2 衍生化時間的選擇

考察溫度37 ℃時，不同衍生時間(0、0.5、1、2、4、8、12、16、24 h)對衍生化效率的影響，不同時間下硝基呋喃化合物的衍生化效率如圖2所示，從圖2可以看出，不同時間的衍生效率接近，無顯著性差異，為了實驗結果可控高效，選取在37 ℃下衍生2 h。

圖2   不同時間下硝基呋喃化合物的衍生化的效率

Fig. 2   The efficiency of derivatization of nitrofuran compounds in different long-term

2.2 基質效應

選取雞蛋、蝦、魚3種陰性基質樣品，按照1.4方法配制基質標準曲線溶液，在1.2儀器工作條件下測定，并繪制含基質樣品的標準曲線。將3種典型基質匹配的標準曲線的斜率(ki)與不加基質樣品配制的標準曲線的斜率(kn)進行比較，斜率的比值見表2，不同基質樣品中4種硝基呋喃代謝物的色譜圖如圖3所示。斜率比值越接近1，說明基質效應越小。由表2、圖3可知，斜率比值為0.884～1.033，4種代謝物的測定沒有受到基質樣品的干擾，說明該方法的基質效應較小，可直接采用不含基質的標準溶液進行定量分析樣品。

表2   基質效應結果

Tab. 2   Results of matrix effect

注：ki—含基質的標準曲線的斜率； kn—不加基質的標準曲線的斜率。

圖3   不同基質樣品中4種硝基呋喃代謝物的色譜圖

Fig. 3   Chromatogram of four nitrofuran metabolites in different samples

1—AMOZ；2—SEM；3—AHD；4—AOZ；

 

2.3 線性方程、檢出限與定量限

按1.3方法配制系列混合標準工作溶液并繪制標準曲線，按照3倍信噪比對應的質量濃度為檢出限，10倍信噪比對應的質量濃度為定量限。

硝基呋喃代謝物的線性范圍、線性方程、相關系數、檢出限與定量限見表3，由表3可知，AMOZ、SEM、AHD、AOZ在質量濃度在0.5～50 ng/mL范圍內與色譜峰面積線性關系良好，相關系數均不小于0.995。

表3   硝基呋喃化合物的線性范圍、線性方程、相關系數、檢出限與定量限

Tab. 3   Linear range，linear equation，correlation coefficient，detection limit and quantification limit of nitrofuran compounds

 

2.4 加標回收與精密度試驗

稱取雞蛋、魚、蝦等陰性樣品各2 g，分別加入100 ng/mL混合標準儲備溶液0.02、0.05、0.1 mL (分別相當于2、5、10 μg/kg的硝基呋喃代謝物)，加入100 ng/mL混合內標溶液0.05 mL，按照1.3方法處理，在1.2儀器工作條件下測定樣品中的殘留量，加標回收與精密度試驗結果見表4，由表4可知，以上三種基質樣品中加標回收率為88.71～105.16 %，測定結果的相對標準偏差(RSD)為3.12～9.08%(n=6)，表明該方法準確度良好。

表4   加標回收與精密度試驗結果

Tab. 4   Results of spiked recovery and precision test

 

2.5 穩定性試驗

將衍生化后的系列混合標準工作溶液放置2周，分別在第1、2、3、4、5、7、10、14天測定樣品。4種代謝物的穩定性試驗結果見表5，由表5可知，該方法在14天內穩定性良好，檢測樣品時可將衍生化對照品放置保存，可減少檢驗工作量和成本。

表5   穩定性試驗結果

Tab. 5   Result of stability test

 

 

 

3、 結語

 

建立了液相色譜-串聯質譜法同時測定不同基質樣品中硝基呋喃代謝物殘留量的方法，該方法操作簡便、快捷、回收率高，可同時測定雞蛋、蝦、魚等農副產品中的硝基呋喃代謝物。

 

 

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引用本文： 邢海艷，孫麗，吳旭，等 . 液相色譜-串聯質譜法測定不同基質樣品中硝基呋喃代謝物殘留量［J］. 化學分析計量，2024，33（7）：101. (XING Haiyan, SUN Li, WU Xu, et al. Determination of nitrofuran metabolite residues in different samples by liquid chromatography tandem mass spectrometry[J]. Chemical Analysis and Meterage, 2024, 33(7): 101.)