今天我們一起參照ChP2020版《0931溶出度與釋放度測定法》和USP <1092>溶出方法的開發(fā)與驗證的內(nèi)容一起來學(xué)習(xí)一下溶出方法開發(fā)過程中所需要掌握的核心要點。

在進行溶出分析方法開發(fā)過程中，我們一般認為一個好的溶出測試方法應(yīng)能提供三個關(guān)鍵方面的信息。

其一，溶出方法和檢測方法協(xié)同作用下能夠準確的反應(yīng)出固體制劑藥物釋放速率或濃度的變化，通過對這些信息的準確監(jiān)控能夠有效地建立起B(yǎng)atch TO Batch質(zhì)量一致性的控制手段；

其二，開發(fā)成型的溶出方法和檢測方法能夠準確區(qū)分CMC過程中不同處方和工藝制備的產(chǎn)品，也就是說溶出分析方法具備處方成分及工藝的敏感性；

其三，溶出曲線能夠在適當體內(nèi)-體外模型條件下準確反應(yīng)釋放-吸收形態(tài)學(xué)特征。

相信從上文介紹中小伙伴們也都觀察到了，溶出分析方法開發(fā)過程中會被“割裂”成相互關(guān)聯(lián)但有具備一定獨立性的兩個部分，即溶出實驗部分和檢測實驗部分。

1、溶出介質(zhì)及其體積

在進行溶出方法開發(fā)時，首要考察的就是溶出介質(zhì)，在進行溶出介質(zhì)選擇過程中需要根據(jù)原料藥、輔料等理化性質(zhì)進行合理篩選，當需要確定溶出度實驗過程中溶出介質(zhì)的成分組成時，還需要對緩沖液、溶液pH、表面活性劑（陽離子、陰離子、兩性等）影響進行充分評估。

一般而言，在進行固體制劑溶出介質(zhì)的考察時，我們以各國藥典作為主要參考依據(jù)，同時根據(jù)實際生產(chǎn)工藝進行綜合研判，選擇出具有強區(qū)分力的介質(zhì)，且通過搖瓶法來測定API在不同介質(zhì)狀況下的飽和濃度，從而更好的佐證和評估藥品的溶解特性。

溶出實驗中常見的溶出介質(zhì)一般包括：稀鹽酸、磷酸/醋酸緩沖溶液（pH值范圍為1.2-7.5）、人工胃液/腸液（可含活性酶）等。在溶解介質(zhì)的選擇過程中還需要充分考量表面活性劑的助溶、增溶和潛溶作用，對于部分藥物在不相溶的特定緩沖溶液中可能需要添加部分表活成分或者改變酸堿的濃度，進而充分達到溶出的目的。

有時候水溶性介質(zhì)中(酸性水溶液或緩沖溶液)可能添加一定比例的表面活性劑(如十二烷基硫酸鈉(SDS)，聚山梨醇酯，或十二烷基二甲基氧化胺)以提高藥物的溶解度。在進行表面活性劑的添加考察過程中要充分注意表活的生理毒性（陽離子>陰離子>非離子）和溶血作用（聚乙烯烷基醚>聚氧乙烯芳基醚>聚氧乙烯脂肪酸酯>吐溫類,吐溫20>吐溫60>吐溫40>吐溫80）。并且在確定表面活性劑后還應(yīng)充分考察表面活性劑濃度變化的影響，從而掌握最低添加量。下表1中對表面活性劑的臨界膠束濃度(CMC)進行簡單列舉，通常在進行溶出介質(zhì)考察過程中表面活性劑的添加濃度近似與其CMC值。

▲表1-常規(guī)表面活性劑CMC濃度舉例

此外還應(yīng)該注意，不同級別（純度）的表面活性劑的使用會對藥物的溶解度造成影響。

因此要控制表面活性劑的級別和純度。例如，SDS只有在工業(yè)級和高純度級才可以使用。在使用HPLC方法進行分析時，不同來源的聚山梨酯(吐溫)80會對方法的適用性產(chǎn)生不可預(yù)估的影響。

通常在溶出方法驗證過程中不推薦直接使用純化水作為溶出介質(zhì)，而一般采用緩沖鹽溶液，因為純化水的質(zhì)量和pH條件并不能穩(wěn)定重現(xiàn)，其受到實驗室潔凈環(huán)境、溫度、制水儀器等多方條件的影響，無法像緩沖鹽溶液一樣便于程序化控制。但在某些特殊情況下（如：pH不敏感制劑等）也可以采用純化水作為溶出介質(zhì)，從而降低實驗強度。

當前溶出方法開發(fā)驗證過程中也見識到部分兄弟單位的小伙伴會選用生物相關(guān)介質(zhì)進行溶出實驗，個人在這里持有中立的態(tài)度，如果生物介質(zhì)并沒有臨床數(shù)據(jù)相關(guān)性作為支撐的話，這套溶出方法的不可預(yù)測性就會大大增加！！！并且生物相關(guān)介質(zhì)其成本和風(fēng)險控制需求將會幾何倍數(shù)的提高，往往還會陡增溶出開發(fā)的難度。因此個人認為在進行溶出方法開發(fā)過程中最優(yōu)選擇依舊是簡單的緩沖鹽體系，匹配目標化合物自身特性所建立的方法可能具備強可預(yù)測性。

溶出實驗的結(jié)果對于處方工藝精進具有重要的作用，通常溶出相關(guān)介質(zhì)用于模擬復(fù)雜的人體胃腸道溶液，從而更好掌握某一化合物在體內(nèi)的溶解性和穩(wěn)定性，同時也用于處方篩選。

日常進行溶出方法開發(fā)過程中溶出介質(zhì)的體積會控制在500-1000mL，溫度保持在37±0.5℃，測試裝置(如籃或槳)固定到軸上后，調(diào)節(jié)至規(guī)定的轉(zhuǎn)速。按照藥典要求將裝置固定到軸上的相對位置上。在溶出過程中，應(yīng)蓋住溶出杯防止溶出介質(zhì)的蒸發(fā)（需要注意的是溶出介質(zhì)種類和體積需要滿足漏槽條件，即介質(zhì)體積至少是能形成其飽和溶液體積的3~7倍，是做溶出的最佳條件）。倘若在制劑的溶出曲線測定過程中溶劑的體積超過此漏槽條件，可視樣品在溶劑中的溶出過程不受溶劑體積的影響。

一個藥品的所有規(guī)格最好使用同一種方法和相同的介質(zhì)體積，這樣可以對各個規(guī)格的溶出曲線進行評估，也能對相同或相似處方進行溶出評價。這種方法可以揭示高規(guī)格和低規(guī)格是否在體外溶出相似。此外，不同規(guī)格使用相同的溶出方法，可以在特定情況下為只研究高規(guī)格和低規(guī)格提供便利。

2、溶出方法及其轉(zhuǎn)速

中國藥典中常用測定方法包括第一法（籃法）、第二法（漿法）、第三法（小杯法）。其中小杯法的適用范圍小。

籃法——75rpm/100rpm，以100rpm為主。適用范圍有膠囊劑、丸劑、片劑、或是一些漂浮的制劑。

槳法——50rpm/75rpm，以50rpm為主。適用范圍有片劑、膠囊劑和丸劑。（經(jīng)驗認為槳法50rpm相當于轉(zhuǎn)籃法100rpm）

只有當指導(dǎo)原則推薦的轉(zhuǎn)速參數(shù)不適用的情況下，才可考慮使用其它轉(zhuǎn)速，使用其它轉(zhuǎn)速應(yīng)有充分證據(jù)。選擇一個不同的介質(zhì)（例如，對這個化合物具有較高溶解度的）來加快溶出比增加轉(zhuǎn)速更好。

當使用籃法裝置時，應(yīng)將樣品放在干燥的籃里，籃固定在連接的圓盤上，然后降低至規(guī)定的位置，立即開始轉(zhuǎn)動。當使用槳法時，樣品應(yīng)在溶出杯的底部，立即按規(guī)定轉(zhuǎn)速開啟槳。如果要求使用沉降裝置，樣品應(yīng)放在沉降裝置中，使其沉于溶出杯底部。在合適的時間點取樣，用合適的方法濾過，濾液作為樣品溶液。分析樣品溶液中的藥物，以相對標示量的百分含量表示規(guī)定時間的溶出量。

在使用沉降籃對易于漂浮的劑型進行溶出測定時，應(yīng)充分評估不同類型沉降籃對溶出結(jié)果所產(chǎn)生的影響，沉降溶出曲線會造成顯著的影響！當轉(zhuǎn)移這個方法時，原則上應(yīng)使用相同的沉降籃，如果無法獲得相同沉降籃必須使用不同設(shè)計的沉降籃時，則應(yīng)當證明兩種不同的沉降籃產(chǎn)生的結(jié)果相同。

在溶出方法開發(fā)中一個好的診斷工具是在溶出試驗結(jié)束后增加“無限轉(zhuǎn)速”（即無窮大點），以使顆粒被強制分散同時使未溶解的API溶解。例如，可在最后一次正常取樣點后，將轉(zhuǎn)速增加至150~250rpm維持15~30min，再進行取樣。這種做法可以快速檢查制劑的含量，并確保溶出不是受到溶解度的限制或者低的溶出量不是由含量低引起的。雖然在溶出曲線中不要求100%的溶出，但是無限點可以比較藥物的均一性并可以提供有用的信息，用于評估初始開發(fā)過程中的制劑特性或方法偏差。然而對于批放行檢驗，轉(zhuǎn)速的增加值是受到限制的。

3、取樣時間點、過濾及終點確定

在速釋制劑溶出方法開發(fā)時，取樣時間點一般從5min到60min以上。5min點可用于混懸劑或其它快速溶出劑型，此時變異不高。典型的取樣時間為 15、30、45、60min。然而，取樣時間點取決于產(chǎn)品特性和方法追蹤處方核心屬性的能力。如果希望更好地研究或追蹤崩解效應(yīng)，5min或10min時間點都是需要的。對于快速溶出產(chǎn)品，光纖溶出系統(tǒng)可以通過更多的取樣時間點得到更好的溶出曲線。如果在溶出液穩(wěn)定性方面有顯著的風(fēng)險，那么應(yīng)在60min后增加一個取樣時間點以保證至少獲得85%的平均溶出量（Ps.實際取樣時間與規(guī)定時間的差異不得過±2%，自取樣至濾過應(yīng)在30秒內(nèi)完成。）。

一般來講，15min點是很有用的，特別是化合物在這段時間內(nèi)已經(jīng)溶出至少85%。如果是在0.1M HCl中滿足這種情況，F(xiàn)DA通常判定這個制劑的行為與溶液一樣，無任何生物利用度方面的問題。15min這個時間點也是BCS3類藥物能否獲取BE豁免的一個重要時間結(jié)點。另外，經(jīng)驗而言，對于在15min內(nèi)溶出≥85%的溶出曲線，其相似性評價時可以不采用f2因子法。

如果使用f2因子法，則需要進行多個時間點溶出度測定，至少兩個取樣時間點平均溶出值低于85%(一般是n=12)并且兩組產(chǎn)品的溶出度值只有一個時間點大于85%。因此，在早期增加時間點檢查是有必要的。

對于緩釋劑型溶出試驗，至少選擇三個時間點確定體外釋放曲線，確保藥物釋放完全(>80%)；對于含有多個活性成分的產(chǎn)品，需要確定每種活性成分的藥物釋放。

為獲得準確試驗結(jié)果，過濾是樣品制備的一個關(guān)鍵步驟。過濾可除去會干擾分析測定的不溶性輔料。如果不把未溶解的藥物和輔料從樣品溶液中除去，那么未溶解的藥物顆粒將會繼續(xù)溶解使試驗結(jié)果出現(xiàn)偏差，因此，如果取樣管中沒有過濾器，應(yīng)立即對溶出度樣品進行過濾。

選擇適當?shù)倪^濾材料是非常重要，應(yīng)該在早期溶出方法開發(fā)的過程中通過實驗確定和完成。在選擇濾膜時有必要重點考慮濾膜的材料、型號和孔徑大小。通常根據(jù)對早期階段溶出方法開發(fā)過程的評價選擇過濾器，但在后期試驗中如果制劑成分改變或組成成分質(zhì)量變化可能需要重新考慮過濾器(例如:微晶纖維素粒徑的改變)。

用于溶出試驗的過濾器有管路過濾器、過濾盤或玻璃過濾器、濾頭或針頭式過濾器，過濾材料在選用的過程中必須確認其與介質(zhì)和藥物相適合。對溶出樣品進行過濾不但可以減少取樣后API顆粒的溶出，還可以降低輔料顆粒堵塞分析設(shè)備的風(fēng)險。典型的濾膜孔徑是0.20~70µm。如果原料藥的粒度很小(例如，微分化顆粒或納米顆粒)，分析者應(yīng)盡可能使用最小孔徑的濾膜，就目前的過濾技術(shù)而言對這類微小顆粒的過濾至今仍具有一定的挑戰(zhàn)。

藥物的劑型、含量及其UV吸收等對溶出分析方法起到?jīng)Q定性的作用，HPLC/UPLC是一種典型的分析方法，在LC分析中，對低規(guī)格藥物通常建議采用增加進樣體積的手段來增加檢測靈敏度，而非增加濃度的方法（即減少溶出介質(zhì)）。

4、色譜條件的確認

在方法最初開發(fā)階段，溶出方法的定性評估可以節(jié)約大量的時間，某一測試的要求沒有滿足，可以不進行樣品分析。通過觀察制劑的溶出現(xiàn)象，可以在不進行樣品分析時就能很快的發(fā)現(xiàn)處方或溶出方法的問題。

溶出度的檢測方法，首選以含量測定方法為原點進行優(yōu)化。若含量測定方法合適，則可與其方法一致，省去一部分開發(fā)內(nèi)容。但也存在含量測定方法監(jiān)測時間過長的情況！倘若采集時間較長（一般認為液相方法采集時間＞20min，就算偏長了，具體情況自行評估喔~），建議對流動相梯度進行針對性優(yōu)化，盡可能的縮短采集時間，否則就后續(xù)溶出曲線的測定將會是一件漫長的事情……時間一長就難保不會出現(xiàn)其他意外（穩(wěn)定性？溶出控制？溶出節(jié)點把控等等……）

對含量測定的方法挪作“他”用，用于測定溶出度時，由于其溶出介質(zhì)和含測過程中的溶劑會具有一定的差異性，分析目標物的濃度也不具備穩(wěn)定性（不斷溶出不斷升高），因此在分析過程中色譜柱載量需要重點關(guān)注，目標物的峰形和柱效也有變化的可能~因此需要著重考察系統(tǒng)適應(yīng)性相關(guān)參數(shù)。

綜合上述的介紹可以看出，要想做好一個完善的溶出方法學(xué)，不僅離不開對液相方法開發(fā)，還要增加大量的溶出內(nèi)容的開發(fā)，就其難度系數(shù)而言算是所有方法學(xué)開發(fā)驗證過程中較為復(fù)雜的一類。