背景

治療性單克隆抗體(mAb)在治療腫瘤藥物中起到非常關鍵的作用，目前已經批準上市的單克隆抗體藥物大約200種，其中治療腫瘤相關疾病的大約90種。單克隆抗體作為免疫治療癌癥的方法已在各種癌癥類型的治療中得到驗證，并取得良好的效果，多款以PD-1等免疫檢查點作為靶點上市的抗體藥物成為了mAb治療癌癥的代表[1]。

在這些藥物的研發過程中，受體占有率（Receptor Occupancy，RO）可以反映抗體等蛋白類藥物與細胞表面靶點的相對結合程度，受體占有率生物分析是抗體等大分子藥物臨床開發中重要的藥效學（PD）指標之一[2]。RO生物分析有助于建立生物治療劑的最小生物效應水平，并建立最佳的給藥方案[3]，也可以幫助更好理解藥代動力學-藥效學（PK-PD）的關系[4]。此外，RO分析生成的數據可用于評估安全性，例如，長期最大RO可能是過量給藥的標志，與靶點長期結合，可能導致嚴重的副作用甚至毒性[5-6]。近年來，包括PD-1/PD-L1,Tim-3,LAG-3,4-1BB,CD3和CD47等眾多靶點的單抗藥物在臨床的研究中，RO的生物分析都起到了非常重要的作用。

什么是受體占有率

RO，即受體占有率（Receptor Occupancy），是檢測蛋白類藥物對特定細胞亞群表面的特異靶點占據的程度（圖1）。蛋白類藥物主要包括單克隆抗體、配體、ADC和融合蛋白等；細胞亞群一般為外周血細胞，如紅細胞、血小板、白細胞亞群（T細胞/B細胞/NK/單核/粒細胞等）；藥物靶點主要涉及PD-1/PD-L1、Tim3、4-1BB、CCR4、CD3和CD20等。

圖1 :RO檢測示意圖，圖片引自文獻[7]

生物分析在藥物臨床研究中的意義

首先，劑量選擇方面，RO生物分析可輔助早期劑量設定，隨著藥物濃度的增加，可以檢測出RO飽和時所需的藥物濃度；也可以幫助評估生物制劑的最小生物效應水平[3]，在劑量爬坡實驗中，可以幫助評估最佳給藥劑量，其次，藥理監測方面：RO生物分析可監測治療藥物與靶點的持續結合，評估給藥間隔、頻次等；例如，隨著時間推移，RO在飽和后，又會逐漸的降低，藥效也可能會降低，此時，再次給藥，RO將再次達到飽和；同時，RO生物分析也可以作為生物標志物評估PK/PD的關系[4]；然后，安全評估方面RO生物分析可評估靶點可能存在的安全風險，如CD47單抗的靶點位于腫瘤細胞，但紅細胞也表達該靶點，紅細胞上RO增加將會導致的紅細胞裂解，進而引起貧血，這種情況下，紅細胞的RO生物分析就顯得十分重要；最后，RO生物分析可以評估長期飽和RO所導致毒副作用以及靶點非特異結合所產生的毒性[5-6]。

受體占有率的生物分析策略

平臺的選擇：流式細胞平臺是臨床前和臨床試驗中生物標志物分析和藥物開發強有力的工具，因為它能夠在單細胞水平上檢測多種異質細胞群以及其表達的靶點，故可以檢測靶點在感興趣的細胞群體上與藥物的結合，評估靶點與藥物結合的程度。

策略選擇：RO生物分析的基本策略包括兩大類：直接法和間接法，這是RO分析兩種最基本的形式，在實際應用中兩種方式會有多種變化形式。直接法：臨床給藥后，需同時測出占據靶點位點的數量（圖2-B）和藥物飽和時位點的數量，其中飽和位點的檢測需要在樣本中加入過量藥物，這樣可以使所有的靶點均被占據。基本計算公式如下：RO的計算是受體占有率%=結合受體量/總受體量×100%；直接法中，檢測試劑（檢測抗體）的篩選非常重要。檢測試劑的選擇可以有多種，根據不同的藥物，選擇通用型抗人IgG的抗體，抗IgG亞型抗體或抗藥抗體。

間接法：使用和藥物非競爭性的抗體測出靶點的總量（圖2-C），使用和藥物競爭的抗體測出游離位點（圖2-A）也就是沒有被藥物占據的靶點的量，兩者相減后，除以靶點總量即可得出受體占有率。基本公式如下：受體占有率%=100%-游離受體/總受體×100%。間接法的檢測試劑的選擇同樣重要，其中篩選到合適的競爭性抗體是關鍵。此外也可以采用熒光標記藥物進行間接法受體占有率測定。

圖2：受體占有率分析的基本策略（圖2引自文獻[8]）

數據表現形式：（1）陽性百分比；(2)平均熒光強度或者等量可溶性熒光分子量（molecules of equivalent soluble fluorochrome ，MESF）。

RO分析的基本策略的設計考量點

首先需要考慮的就是藥物背景及臨床方案，抗體的IgG亞型會影響試劑的選擇，而抗體的結構是單抗還是雙抗或者多功能抗體也會影響基本策略的選擇和結果計算及分析；臨床方案中是否聯合用藥，聯合用藥是否感染干擾目標受體的檢測；還要考慮藥物是否會產生明顯的免疫原性，ADA或者Nab也會影響受體的檢測 ；如果臨床考察RO的目的除了藥效還有安全性的考慮，則RO生物分析可能還要涉及安全性相關的細胞群（比如：紅細胞）。與此同時，了解靶點（受體）在哪些細胞群表達以及在細胞群的表達豐度會幫助科學篩選目標細胞群和準確的計算RO。最后，樣本的類型（外周血\PBMC\腫瘤等）、儲存條件和處理方法等也需要考慮進去。

受體占位生物分析挑戰

由于藥物結構復雜和靶點多樣化以及表達差異等原因，RO生物分析方法的建立具有相當的挑戰，本文主要討論在臨床樣本進行RO分析時主要有以下幾個挑戰：（1）樣品穩定性：臨床采集全血樣本或者組織樣本均涉及新鮮活細胞，從研究場所采集運輸到檢測實驗室，通常需要相當的時間，如果樣品穩定性控制不好，從樣品采集到分析的時間即可能會影響實際RO水平。針對不同的靶點可以使用不同類型抗凝劑或市售的穩定試劑，可以優化和延長樣品穩定性。如果穩定期太短，可能要在采集后進行固定和染色。（2）臨床樣本量不足：由于單次檢測RO通常至少需要100μl左右全血，再加上復管和對照管，可能需要更多體積的全血，而臨床采集的全血樣本通常有多個檢測目的，此時可以考慮使用多重檢測的方式，同時檢測免疫表型和相關靶點RO，這樣可以節約全血的體積，同時也對人員和儀器都有更高的要求。（3）靶點在靶細胞上表達量低：例如Tim3，在靶細胞上表達很低，對方法驗證的完成造成了挑戰，此時需要跟據不同的靶點選擇不同的刺激劑，來增加靶點的表達。選擇可替代的表達靶點較高的細胞群也是可以選擇的方案。（4）生物變異性：在RO分析策略設計之前，要充分考慮到檢測靶點的測量范圍，用于方法驗證的樣品的分析物的檢測值應該覆蓋預期的樣本中分析物的檢測范圍。（5）免疫原性：樣本中含有ADA可能會影響RO的檢測。（6）關鍵檢測試劑：篩選完全競爭或者特異性良好的抗體也是方法開發和驗證中重要的環節。

結語

開發和驗證準確及穩定的受體占有率生物分析方法在藥效動力學等方面起到非常重要的作用，然而，由于抗體藥物本身結構復雜且靶點多樣化，在開發和驗證其生物分析方法中充滿了挑戰。流式細胞平臺（FACS）具有強大的檢測異質細胞群和與靶點與細胞結合的能力，通常RO分析會選擇該平臺。對于藥物結構和特點以及靶點的生物學背景的深刻理解是方法成功開發的前提，基本策略的選擇、關鍵試劑篩選和穩定性驗證等方面均是方法開發的基本環節。目前藥明康德測試事業部臨床生物分析團隊已經開發并驗證了多種符合GLP法規要求的RO生物分析方法，藥物蛋白的種類包含單抗、雙抗和多功能抗體，所涉及的靶點包括PD-1、PD-L1、Tim-3、LAG-3、4-1BB、CD3和CD85d等。在FACS平臺積累了豐富的RO生物分析經驗，可以幫客戶解決抗體等大分子藥物再臨床生物分析中遇到的各種挑戰，加速藥物研發和上市的進度。

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