導(dǎo)語：本文為學(xué)習(xí)性總結(jié)，主要參考山東省醫(yī)療器械和藥品包裝檢研究院孫曉霞老師對GB/Z 16886.22-2022《醫(yī)療器械生物學(xué)評價 第22部分：納米材料指南》國家標(biāo)準(zhǔn)指導(dǎo)性技術(shù)文件解讀以及《應(yīng)用納米材料的醫(yī)療器械安全性和有效性評價指導(dǎo)原則》，主要從納米材料的介紹、涉及標(biāo)準(zhǔn)、理化表征和生物學(xué)評價等方面進(jìn)行介紹，以為諸君提供點滴參考。
第一部分涉及標(biāo)準(zhǔn)簡介
相關(guān)指導(dǎo)原則：
應(yīng)用納米材料的醫(yī)療器械安全性和有效性評價指導(dǎo)原則第一部分：體系框架
應(yīng)用納米材料的醫(yī)療器械安全性和有效性評價指導(dǎo)原則第二部分：理化表征
應(yīng)用納米材料的醫(yī)療器械安全性和有效性評價指導(dǎo)原則第三部分：生物相容性/毒理學(xué)評價（征求意見稿）
相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)：
GB/Z 16886.22 《醫(yī)療器械生物學(xué)評價 第22部分：納米材料指南》
ISO /TR 16197 -2014 《Nanotechnologies — Compilation and description of toxicological screening methods for manufactured nanomaterials》
YY/T 1295《醫(yī)療器械生物學(xué)評價 納米材料：細(xì)菌內(nèi)毒素試驗》
YY/T 0993《醫(yī)療器械生物學(xué)評價 納米材料：體外細(xì)胞毒性試驗（MTT試驗和LDH試驗）》
YY/T 1532《醫(yī)療器械生物學(xué)評價 納米材料 溶血試驗》
YY/T 1863《納米醫(yī)療器械生物學(xué)評價 含納米銀敷料中銀顆粒和銀離子的釋放與表征方法》
GB/T 38261《納米技術(shù) 生物樣品中銀含量測量 電感耦合等離子體質(zhì)譜法》
GB/T 39261-2020,納米技術(shù) 納米材料毒理學(xué)評價前理化性質(zhì)表征指南
ISO/TR 13014：2012 納米技術(shù)——工程納米材料理化特性毒理學(xué)評估指南Nanotechnologies-Guidance on physico-chemical characterization of engineered nanoscale materials for toxicologic assessmen.
ISO 21363:2020, Nanotechnologies - Measurements of particle size and shape distributions by transmission electron microscopy.
GB/Z 10886.22是指導(dǎo)性技術(shù)文件，它等同于ISO10993.22。根據(jù)新修訂的GB/T 16886.1-2022，新增了關(guān)于納米材料的生物學(xué)評價。納米材料的生物學(xué)評價內(nèi)容中，新增了8項內(nèi)容，分別是3.15的納米材料以及6.1生物學(xué)風(fēng)險分析的物理化學(xué)信息等相關(guān)內(nèi)容。關(guān)于納米材料生物學(xué)評價和風(fēng)險的內(nèi)容，由于納米材料具有潛在獨特性，如生物持久性和生物蓄積，因此對生物學(xué)評價和風(fēng)險評估提出特定挑戰(zhàn)。GB/Z16886.22標(biāo)準(zhǔn)全面考慮了醫(yī)療器械領(lǐng)域的納米材料和納米技術(shù)可能帶來的風(fēng)險，并對如何評價這些風(fēng)險提出了指導(dǎo)性建議。
第二部分應(yīng)用納米材料的醫(yī)療器械介紹
現(xiàn)有的醫(yī)療器械中應(yīng)用的納米材料包括添加到醫(yī)療器械中的游離態(tài)納米材料，利用納米材料特性增加生物學(xué)活性（如醫(yī)用納米羥基磷灰石/聚酰胺66復(fù)合骨充填材料）或者預(yù)防感染（如納米銀創(chuàng)傷貼）的固化納米材料以及利用納米技術(shù)設(shè)計制備成納米結(jié)構(gòu)的醫(yī)療器械（如口腔種植體材料表面納米化處理）等。此外，即使醫(yī)療器械本身不含有納米材料，其使用/植入過程也有可能導(dǎo)致納米顆粒的產(chǎn)生。
也就是說有納米材料組成或包含納米材料的醫(yī)療器械，以及在醫(yī)療器械或組件生產(chǎn)過程中未使用納米材料，但降解磨損或在機(jī)械處理過程中，如醫(yī)療器械原位研磨拋光等產(chǎn)生的納米物體。同時，GB/Z 16886.22內(nèi)容也提出了不適用情況：例如未經(jīng)設(shè)計制造或加工應(yīng)用于醫(yī)療器械中的天然和生物納米材料以及塊體材料內(nèi)部的納米結(jié)構(gòu)；在設(shè)計制造加工過程中，非預(yù)期產(chǎn)生的醫(yī)療器械表面的納米結(jié)構(gòu)（如擠壓劃線和機(jī)加工/工具標(biāo)記）。
常用的概念或術(shù)語
首先，大約處于1納米到100納米之間的長度范圍的納米尺度，包含納米尺度現(xiàn)象，即由此尺度范圍產(chǎn)生的效應(yīng)和納米尺度性質(zhì)。納米物體是指一維、二維或三維外部維度處于納米尺度的離散物體，而納米材料是任意外部維度、內(nèi)部或表面結(jié)構(gòu)處于納米尺度的材料，包括工程化、伴生納米材料和人造納米材料。
其次，納米結(jié)構(gòu)和納米顆粒是所有外部維度均在納米尺度的納米物體，其中納米物體的最長和最短軸的長度沒有顯著差異。這里涉及到納米片和納米纖維，它們都是納米顆粒的一種內(nèi)容。納米纖維包含納米棒和納米管，納米棒是固體的納米纖維，納米管是中空的納米纖維。
這種團(tuán)聚體，如范德華利或簡單的物理團(tuán)結(jié)，聚集體團(tuán)聚體被稱為次級顆粒，原顆粒則被稱為初級顆粒。另一個重要定義是測試參考材料，它是一種或幾種特定性質(zhì)足夠均勻或穩(wěn)定的材料，適用于目標(biāo)量值測量和測定測試方法的開發(fā)。與其他特定性質(zhì)相比，該目標(biāo)量值尚未進(jìn)行均勻性和穩(wěn)定性評估。
第三部分 納米材料的風(fēng)險評估
關(guān)于納米材料的風(fēng)險管理，首先要明確適用范圍，包含由納米材料組成的器械降解磨損或從器械處理工藝過程中產(chǎn)生的納米材料。風(fēng)險管理首先要發(fā)現(xiàn)危害，并考慮危害識別。醫(yī)療納米材料的物理、化學(xué)和毒理學(xué)特性，包括添加劑和加工助劑。作為應(yīng)用納米材料醫(yī)療器械風(fēng)險評估組成部分的安全性評價流程圖如下圖所示。
應(yīng)用納米材料的醫(yī)療器械風(fēng)險評估：階段法
在技術(shù)評估時，需考慮納米材料在醫(yī)療器械中的濃度、預(yù)期用途、接觸途徑、釋放速率和模式以及對患者接觸情況的估計。GB/Z16886.22中已明確了由納米材料組成的醫(yī)療器械進(jìn)行生物學(xué)評價的考慮因素。我們將醫(yī)療器械中的納米材料分為5類。然而，我們需要指出一種器械可能涉及多個類別的納米材料，例如除表面結(jié)構(gòu)外，還包含器械表面或內(nèi)部的納米物體，納米結(jié)構(gòu)有意義或者預(yù)期可能被器械釋放。納米物體可以從不含納米物體的醫(yī)療器械中產(chǎn)生。對于使用降解磨損或處理包含納米物體的醫(yī)療器械，我們在評價生物學(xué)時需要對其產(chǎn)生額外的新的非預(yù)期納米物體。
第四部分 應(yīng)用納米材料醫(yī)療器械的理化表征
納米材料因其獨特的尺寸小、比表面積大和化學(xué)活性高等特點，在醫(yī)療器械領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用前景。然而，這些特性也使得納米材料在不同環(huán)境中的表面特性和聚集狀態(tài)容易發(fā)生變化，給納米材料的生物學(xué)效應(yīng)評估帶來了挑戰(zhàn)。
為了確保應(yīng)用納米材料的醫(yī)療器械的安全性和有效性，全面而準(zhǔn)確的理化性質(zhì)表征以及使用過程中納米材料理化性質(zhì)變化的測量至關(guān)重要。
首先，表征對象是最終器械上具有代表性的樣品，或與最終醫(yī)療器械同樣方式加工而成的材料。根據(jù)產(chǎn)品及納米材料的性質(zhì)，可以選擇不同階段的理化檢測項目，以對納米原材料、醫(yī)療器械終產(chǎn)品中的納米材料以及生物組織樣本中的納米材料三個層次進(jìn)行表征。
納米材料的理化表征流程圖可以參考下圖（a）。流程圖（b）中給出了各階段理化表征的建議檢測項目。該理化表征可分為三個層次：
納米原材料：對納米材料的基本特性進(jìn)行表征，包括尺寸、形狀、表面特性等。
醫(yī)療器械終產(chǎn)品中的納米材料：對醫(yī)療器械中的納米材料進(jìn)行表征，包括納米材料的穩(wěn)定性、分布情況等。
生物組織樣本中的納米材料：對應(yīng)用納米材料的醫(yī)療器械釋放的納米材料在生物組織樣本中的分布和轉(zhuǎn)化情況進(jìn)行表征，以評估納米材料的生物分布和生物轉(zhuǎn)化情況。
GB/T 39261-2020《納米技術(shù) 納米材料毒理學(xué)評價前理化性質(zhì)表征指南》中也提到了納米材料特性的參考參量值以及測量參數(shù)示例，具體如下表所示。此外，我們還需要對納米材料的結(jié)晶度、孔隙率等附加屬性進(jìn)行評估。對于含納米多孔材料，我們還需要考慮由于孔隙或者空隙造成的尺寸、結(jié)構(gòu)密度分布等特性的特定區(qū)別。
納米材料的表征和實驗結(jié)果的描述如下圖所示，我們提供了關(guān)鍵數(shù)據(jù)，包括樣品制備、實驗條件、標(biāo)準(zhǔn)分析、檢驗方法的描述。醫(yī)療器械材料降解和潛在納米物體的釋放評估、實驗方法步驟、降解產(chǎn)物的定性和定量研究、討論和結(jié)論。
第五部分 應(yīng)用納米材料醫(yī)療器械的生物學(xué)評價
在進(jìn)行納米材料生物安全性測試時，首先要根據(jù)器械設(shè)計、用途和磨損特性來考慮。實驗時，要考慮實驗介質(zhì)與納米材料之間的相互作用，以及與體液接觸可能改變納米材料的表面表征，從而改變其生物學(xué)行為的可能性。同時，要判斷實驗系統(tǒng)是否具有臨床代表性，例如體外模擬原位磨損產(chǎn)生的納米材料或納米物體是否符合生物學(xué)安全性實驗測試體系。
5.1參照材料
納米材料生物學(xué)評價的重要內(nèi)容是參考材料，即實驗系統(tǒng)對照品的選擇。測試參考材料的定義是一種或幾種特定性質(zhì)足夠均勻和穩(wěn)定的材料，適用于目標(biāo)量值的測量和測試方法的開發(fā)。
目前，納米材料缺少陽性和陰性對照樣品，但對照樣品的測試可重復(fù)性和可靠性至關(guān)重要。因此，我們需要針對納米材料的尺寸、形狀、度量值進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化測試參考材料。全球數(shù)據(jù)庫http://www.nano-refmat.bam.de/en/為納米尺度的參考材料提供了數(shù)據(jù)庫，目前可用的納米尺度參考材料包括二氧化鈦、膠體二氧化硅、金和單壁碳納米管。
5.2測試樣品的制備
我們已經(jīng)確定納米材料的來源、風(fēng)險、參考材料等方面。在樣品制備過程中，我們需要確定4個方面的內(nèi)容。
對于納米結(jié)構(gòu)材料和分散體，按照ISO 10993.12樣品制備，通常采用極性和非極性介質(zhì)浸提。然而，需要注意基于介質(zhì)的臨床相關(guān)性和分散性，選擇納米物體和分散體。大多數(shù)納米分散體在極性溶液中制備和使用，在特定測試系統(tǒng)中遞送納米物體時，需要注意增加納米物體反應(yīng)性的表面特性，如聚集或團(tuán)聚體的形成，這些小尺寸對理化性質(zhì)的潛在影響。
我們需要區(qū)分溶解性和分散性，這兩種內(nèi)容對毒性反應(yīng)具有關(guān)鍵影響。當(dāng)可溶或部分緩慢可溶時，納米物體以分子形式存在于實驗系統(tǒng)中；當(dāng)微溶或難溶時，則以分散體形式存在于實驗系統(tǒng)中。這兩種存在形式不同，導(dǎo)致生物學(xué)反毒性反應(yīng)的影響也有所不同。此外，實驗樣品的穩(wěn)定性是關(guān)鍵因素，也是導(dǎo)致實驗結(jié)果具有典型可代表性和可重復(fù)性的關(guān)鍵因素。剛才提到聚集體和團(tuán)聚體的定義，這兩種存在形式的分散受納米物體之間的相互作用和與環(huán)境相互作用的影響。
同時，我們需要特別關(guān)注納米物體的樣品，樣品中的納米物體的分散情況和尺寸分布會隨時間發(fā)生改變。納米結(jié)構(gòu)材料有兩個方面的內(nèi)容，首先是表面積，納米結(jié)構(gòu)的表面增加了器械的總表面積。二是納米材料可能會從納米結(jié)構(gòu)上釋放出來，即嵌入式納米材料和固定在基質(zhì)或表面的納米材料的釋放形式。因此，增加了儲備納米材料的相關(guān)表征內(nèi)容。首先是儲備分散體的制備，其次分散方法可以選擇超聲或攪拌，并考慮是否適用于活性劑等穩(wěn)定劑。在儲存條件上，我們要注意避免極端溫度、亮度、濕度對儲備分散體的儲存穩(wěn)定性的影響。
穩(wěn)定性評價包括兩個方面：一是納米材料的溶解、降解或轉(zhuǎn)化是否隨時間變化；二是納米粒度的分布或表面電荷是否隨時間變化。在此，我們單獨提出了內(nèi)毒素的觀點：內(nèi)毒素污染可能會干擾生物學(xué)評價實驗導(dǎo)致錯誤結(jié)論。同時，我們還需強(qiáng)調(diào)，傳統(tǒng)的內(nèi)毒素定量實驗并不適用于納米材料，這是因為納米材料會干擾內(nèi)毒素等試劑的反應(yīng)性。通過測定實驗溶液中磷脂的存在和組成來排除內(nèi)毒素。預(yù)防內(nèi)毒素污染有以下幾些措施：一是在制造過程中防止污染；二是注意，滅活內(nèi)毒素的方法可能會改變或?qū)е录{米材料降解。
滅菌方式可能會影響納米材料降解，進(jìn)而產(chǎn)生雜質(zhì)。同時，納米材料中存在的各種不同雜質(zhì)會影響其功能、生物相容性、存在狀態(tài)、聚集狀態(tài)和穩(wěn)定性等因素。若納米材料或者結(jié)構(gòu)顆粒中存在滅菌工藝，將會再次表征滅菌后的納米材料或者產(chǎn)品。另外，伽馬輻照或環(huán)氧乙烷滅菌方法可能產(chǎn)生自由基，影響納米材料的安全性，導(dǎo)致產(chǎn)生有毒降解產(chǎn)物。同時，無菌過濾不適用于包含220納米或者更大粒徑片的納米材料或者高粘度懸浮液。
5.3納米物體在醫(yī)療器械中的釋放，涉及動力學(xué)研究
包括釋放數(shù)量是否發(fā)生遷移以及是否有生物蓄積。這種釋放可能是降解產(chǎn)物的釋放，如含銀輔料中納米銀成分的釋放，以及磨損導(dǎo)致的納米物體釋放，如關(guān)節(jié)置換植入物在使用過程中磨損顆粒的納米物體釋放。此外，還包含原位處理，如齒科材料，在機(jī)械拋光和研磨過程中也可能產(chǎn)生納米制作材料。
5.4 毒代動力學(xué)
毒代動力學(xué)即吸收、分布、代謝和排泄的內(nèi)容。這部分內(nèi)容依據(jù)ISO 10993-16毒代動力學(xué)研究，其危險源是組成單個納米材料的游離、納米物體離子或組分的存在或釋放。這種存在形式包括游離、固定或嵌入。影響毒代動力學(xué)的因素有很多，從理化性能、尺寸、電荷聚集等方面進(jìn)行總結(jié)。生物分子吸附，例如納米顆粒可吸附蛋白質(zhì)，形成蛋白冠，增強(qiáng)單核巨噬細(xì)胞識別和攝取。
接觸途徑?jīng)Q定了生物分布可能存在血液、肝、脾及局部和組織淋巴結(jié)的相互貫通過程。第四方面是劑量，當(dāng)攝入大于清除時可能存在生物蓄積。在進(jìn)行毒理學(xué)毒性動力學(xué)研究時，需關(guān)注物種和性別。例如，雌性大鼠比雄性大鼠更容易發(fā)生納米銀及其衍生物的腎臟蓄積。納米材料的表面結(jié)構(gòu)能影響納米材料與蛋白質(zhì)的相互作用、吸附、循環(huán)和分布，最終影響毒代動力學(xué)。
5.5 毒理學(xué)評價
對于評價終點，我們需基于納米材料在臨床使用時的接觸時間、部位和特性進(jìn)行考慮。對于納米材料的特殊考慮，它在人體內(nèi)可能會發(fā)生全身分布，或者在組織中的分布。納米材料可通過細(xì)胞核線粒體膜干擾或阻斷DNA合成。它可與蛋白等結(jié)合形成蛋白冠，導(dǎo)致生物分子吸附，容易被機(jī)體內(nèi)的巨噬細(xì)胞、炎癥細(xì)胞吞噬或識別。
在實驗過程中，首先要注意納米物體的劑量，包括質(zhì)量、顆粒數(shù)量和表面積。其次，實驗介質(zhì)的pH值、血清濃度是否發(fā)生分散或聚集？懸浮液、重懸液和混懸液等，懸浮狀態(tài)是實驗系統(tǒng)的重要因素。容器材料也關(guān)鍵，納米物體是否易被容器材料吸附，從表面解離或釋放，這些都是實驗過程中需關(guān)注的關(guān)鍵因素。
接下來，我們來探討毒理學(xué)評價終點。
（1）體外細(xì)胞毒性實驗
物體在體細(xì)胞內(nèi)的定位取決于其物理、化學(xué)性質(zhì)、尺寸和計量。首先，細(xì)胞毒性實驗涉及到的細(xì)胞可能包括吞噬和非吞噬性兩種類型。除了常規(guī)的毒性細(xì)胞毒性外，還可能存在氧化應(yīng)激和干擾因素，如生物吸附。另外，常見的MTT實驗或LDH實驗中的染料是否受到納米材料的干擾而影響結(jié)果比色。對于細(xì)胞毒性實驗，計量度量包括納米顆粒，可能存在三個參數(shù)質(zhì)量、表面積和數(shù)量以及可能會影響通過沉淀、團(tuán)聚擴(kuò)散而接觸細(xì)胞的過程。其中，納米顆粒受培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件的影響是實驗中需要關(guān)注的內(nèi)容。
（2）對于遺傳毒性、致癌和生殖毒性
間接毒性包括促氧化作用和DNA修復(fù)抑制。當(dāng)一些研究顯示為陽性，而其他研究沒有顯示時，基于風(fēng)險評估原則，納米顆粒被認(rèn)為具有潛在遺傳毒性。另外，一些研究結(jié)果為陰性，但并無相關(guān)性。這是因為細(xì)菌缺乏內(nèi)吞作用能力，納米材料不易透過細(xì)菌壁，Ames實驗不適用于納米材料的致突變性研究。對于納米物體引起的非遺傳毒性，如炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激和細(xì)胞凋亡，這些作用可能誘發(fā)細(xì)胞癌變。在遺傳毒性實驗時，由于納米物體本身不被機(jī)體代謝，因此在實驗時不需要加入S9肝代謝活化成分。
在開展體內(nèi)遺傳毒性實驗時，我們需要根據(jù)ISO 10993-16毒代動力學(xué)研究，特別關(guān)注納米物體靶器官的體內(nèi)實驗。對于致癌性實驗，除了遺傳毒性，還需關(guān)注由于DNA損傷突變引起的慢性炎癥反應(yīng)和由氧化應(yīng)激導(dǎo)致的致癌性。對于生殖毒性，我們需要強(qiáng)調(diào)納米顆粒能穿透生物屏障，因此它們可以穿透生殖系統(tǒng)屏障，從而影響精子的活力、功能以及胚胎的發(fā)育。免疫毒性方面，納米與蛋白質(zhì)結(jié)合形成蛋白冠，可被單核細(xì)胞計數(shù)系統(tǒng)吞噬。這涉及巨噬細(xì)胞、輸出狀細(xì)胞和朗格漢斯細(xì)胞。
不同形狀的納米物體的滲透性有所區(qū)別，球形納米材料比細(xì)長的納米材料具有更高的滲透性。血液相容性首先涉及納米器械與器械和血液接觸表面積的關(guān)系。納米器械表面積與全血接觸體積的比率是血象性評估的重要因素。這里分別從三個方面進(jìn)行關(guān)注：一是補(bǔ)體系統(tǒng)的激活可以引起巨噬細(xì)胞吞噬納米材料，從而導(dǎo)致急性超敏反應(yīng)。二是尺寸和表面粗糙度在血液血清蛋白吸附程度、血小板粘附和激活以及及全血液凝固動力學(xué)方面起到重要影響作用。納米顆粒與內(nèi)皮細(xì)胞和單核細(xì)胞相互作用，激活相應(yīng)的炎癥因子和表面標(biāo)志物，從而通過內(nèi)皮細(xì)胞或單核細(xì)胞導(dǎo)致激活，影響血液相容性。
植入實驗包括皮下肌肉和顱內(nèi)等，游離納米物體需考慮注射至適宜組織。在納米物體從醫(yī)療器械釋放的情況下，需特別關(guān)注納米物體向局部引流淋巴結(jié)的遷移，即材料介導(dǎo)的致熱性。
5.6生物學(xué)評價報告
通常一份生物學(xué)評價報告包括如下內(nèi)容：
結(jié)束語：本文詳細(xì)介紹了醫(yī)療器械納米材料的相關(guān)指導(dǎo)原則和標(biāo)準(zhǔn)、應(yīng)用納米材料的醫(yī)療器械簡介、應(yīng)用納米材料的醫(yī)療器械的物理化學(xué)表征和生物學(xué)評價等內(nèi)容。
