離子色譜法（IC）是利用流動相與固定相中的離子進行可逆的離子交換，來分離離子態化學物的色譜方法。離子色譜法具有所需樣品量少、專屬性強、靈敏度和準確度高、自動化程度高、 操作簡單等優點，適用于分析各種離子、有機酸、堿、胺類和糖類物質。自從離子色譜法被收載入2010年版《中國藥典》，其在藥物的分析檢測領域也得到越來越廣泛的應用，如陰陽離子(亞硝酸鹽、鹵素離子、硫酸鹽、銨鹽等)、抗生素、中藥材的金屬離子、二氧化硫殘留量、有機酸的分析檢測均有離子色譜的身影。這使得離子色譜法與在藥物分析領域通常采用的紫外-可見分光光度法（UV-Vis）、 高效液相色譜法（HPLC）、氣相色譜法（GC）以及質譜法（MS）等方法形成優勢互補，尤其是彌補了以上幾種常規方法在檢測部分有機酸、陰陽離子等親水性較強的物質方面的不足。眾所周知的是，離子色譜法目前在藥物分析領域仍屬于小眾分析技術，很多研究者甚至沒有接觸過此種分析技術，故本文筆者總結了一套離子色譜分析方法開發思路，共包括八大方面，旨在為廣大研究者們提供參考。
一、離子的種類
確定待分析的離子種類是首要前提，這有助于選擇合適的離子色譜柱和優化分離條件。如金屬離子、銨根離子等陽離子、氨基酸、抗生素及有機胺類化合物適合采用陽離子型交換色譜柱；鹵素離子、亞硝酸根離子、硝酸根離子、硫酸根離子、磷酸根離子等陰離子和有機酸適合采用陰離子型交換色譜柱；糖類物質可采用陰離子型交換色譜柱或專門的糖分析柱（如圖片和圖片），如陳熠熠等圖片建立了離子色譜法分離并測定蜂蜜中糖類物質的方法，他們選取一種陰離子交換柱圖片和兩種糖柱：圖片 和圖片，這三種型號色譜柱進行對比實驗。對比發現圖片柱的分離度最佳；中藥材及飲片中圖片殘留量通常采用陰離子交換色譜柱，如張燁等圖片采用Dionex Ionpac AS19陰離子分析柱，采用8~40 mmol/L氫氧化鉀溶液進行梯度洗脫，電導檢測器檢測，建立了牛黃清胃丸中二氧化硫的殘留量測定方法；此外，還有一些專用的離子色譜柱，如用于圖片和圖片的專用色譜柱SH-AC-14，用于多聚磷酸鹽的專用色譜柱SH-AC-16。
二、樣品的性質和前處理方法
需要考慮樣品的性質，如溶解度、電離效率、穩定性和可能存在的干擾物等，以便確定采取需要何種前處理方式，比如簡單的樣品稀釋，還是需要特殊處理，如過濾、離心、離子交換處理、固相萃取等。一個典型的例子就是鹵素類化合物中的氟、氯、溴離子的檢測，由于以上元素大多以有機物形式存在, 幾乎不能直接檢測，考慮到鹵素元素的電負性相對較高，研究者們大多采用燃燒分解將其轉化成陰離子后進行測定。例如，王瑞萍等圖片建立了氧瓶燃燒-離子色譜法測定塑料中氟、氯、溴三種元素含量的方法。該方法靈敏度、精密度和準確度高，適合測定不同種類塑料藥包材中的鹵素含量。還有研究者們采用過濾、離心等前處理方式以減小基質干擾和提高待測離子的靈敏度。陸溱偉等圖片采用離子色譜法分析齊拉西酮原料藥中甲磺酸根離子時用到了離心和過濾分離。龍四紅等圖片采用離子色譜法測定酸湯中13種有機酸時除用到離心和過濾外，還用到固相萃取。
三、色譜柱的選擇
色譜柱為離子色譜分析的核心，分離各種待分析物的關鍵。應根據樣品類型選擇合適的色譜柱。常見的離子色譜柱包括離子交換柱、離子排斥柱和離子對柱等。
離子交換柱應用離子交換的原理，采用低交換容量的離子交換樹脂來分離離子，主要用于有機和無機陰、陽離子的分離，有的也可用于糖類的分離，比如筆者曾在測定一種注射液中葡萄糖及果糖含量時，采用的是Waters Sugar-Pak I這種鈣基陽離子柱，將葡萄糖與果糖實現良好分離，分離度在2.0左右。離子交換柱是目前應用最廣泛的離子色譜柱。由于離子交換樹脂耐酸堿性強，故離子交換柱可在任何pH范圍內使用，另外易再生處理、使用壽命長；缺點是機械強度差、易溶易脹、易受有機物污染。
離子排斥柱的原理是以硅膠為載體，將有離子交換基的有機硅烷與其表面的硅醇基反應，形成化學鍵合型離子交換劑，基于Donnan排斥作用，是利用溶質和固定相之間的非離子性相互作用進行分離的。它主要用于無機含氧酸根和有機酸的分離，也可以用于醇類、醛類、氨基酸和糖類的分離。筆者在做一種注射液中葡萄糖有關物質含量測定時，采用的是Agilent Hi-Plex H色譜柱，葡萄糖和各有關物質的分離度在2.0以上，各有關物質的檢測限達到0.5ppm。離子排斥柱的優點是柱效高、交換容量高、交換平衡快、機械強度高，缺點是不耐酸堿、只宜在pH 2-8范圍內使用。
離子對柱的分離機理是向流動相中加入離子對試劑，這些試劑被色譜柱的固定相所保留，然后待測物質進入色譜柱后與離子對試劑進行離子交換，利用各待測物的保留不同實現分離。此機理與在液相色譜法的流動相中添加緩沖試劑類似。離子對柱主要用于表面活性陰離子和陽離子以及金屬絡合物的分離。離子對色譜柱可提高對待測物的選擇性，改善保留，但待測物的保留易受離子對試劑濃度、流動相pH、溫度、有機溶劑比例等外部因素的干擾，因此采用離子對色譜柱時建議對各個外部條件做足夠的考察和篩選。
當確定了離子色譜柱類型時，還需要格外注意各個型號色譜柱的pH范圍、最大耐受壓力、最高耐受溫度、適用的溶劑、最佳柱效流速等，以避免離子樹脂失效從而導致柱效下降。
四、流動相（淋洗劑）的選擇和優化
離子色譜法中流動相常被稱作淋洗劑。選擇合適的淋洗劑，優化淋洗劑組成和pH，可提高離子交換能力和分離效果，并改善待測物的保留。與反相液相色譜法不同，離子色譜法采用的淋洗劑常為酸、堿、鹽水溶液，而較少添加有機試劑進行洗脫。根據待測離子的不同，通常的淋洗劑的選擇原則如下：
4.1 分離弱保留離子的淋洗劑
常見的弱保留離子包括一價無機陰離子（如Fˉ、Clˉ、Br-）、短碳鏈一元羧酸（如甲酸、乙酸）和一些弱解離的組分等。分離弱保留離子常用弱淋洗離子，如圖片、OHˉ、圖片(洗脫能力由強到弱)。圖片在電離或水解作用下容易被轉化為圖片，而圖片的淋洗能力較強，不適用于上述弱保留離子，故圖片穩定性欠佳。而圖片在溶液中穩定，此類淋洗劑是分離弱保留離子的優先推薦淋洗劑。
4.2 分離高親和力離子的淋洗劑
對離子交換樹脂親和力強的離子有兩種：一種是離子電荷數大的離子，如圖片、圖片和多聚磷酸鹽等，適用于此類離子的淋洗劑有磷酸鹽水溶液；另一種是離子半徑較大、疏水性強的離子，如Iˉ、SCNˉ、圖片、苯甲酸和檸檬酸等。對于此類離子，推薦方法是在淋洗劑中加入有機改進劑（如甲醇、乙腈和對氰酚等）或選用親水性色譜柱。有機改進劑的作用主要是減少樣品離子與離子交換樹脂之間的非離子交換作用，占據樹脂的疏水性位置，減少疏水性離子在樹脂上的吸附，從而縮短保留時間，減少峰拖尾，并增加檢測靈敏度。
4.3 分離電荷數大的離子的淋洗劑
對于此類離子，常用方法以增加淋洗離子的濃度或選擇強的淋洗離子（如圖片）為主。
離子色譜對于淋洗劑的選擇首要原則是淋洗離子與待測離子的親和力接近，即一價淋洗離子洗脫一價待測離子，二價淋洗離子洗脫二價待測離子。淋洗液濃度的改變對二價和多價待測離子保留時間的影響大于一價待測離子。若多價離子的保留時間太長，增加淋洗液的濃度是較好的方法。另外，還需考慮淋洗劑的pH值帶來的影響：pH值提高，體系內OH-濃度增加，一般情況下待測離子保留時間減小，但對于弱酸、多元酸，pH值提高，電離增加，保留時間反而增加，如圖片、圖片。
五、流速、柱溫和梯度程序的優化
確定了淋洗劑后，選擇合適的流速、柱溫和梯度洗脫程序，以便獲得良好的分離度和柱效，并提高分離效率和分析速度。與液相色譜優化方法相同，有時等度洗脫存在出峰較晚、保留時間較長、峰展寬等問題，此時可考慮提高流速、提高柱溫或更改為梯度洗脫，比如龍四紅等圖片采用離子色譜法測定酸湯中13種有機酸時，采用的是梯度洗脫，并對流速進行過考察。結果表明，流速為1.5 ml/min（最高流速）時既可保證分離度，又可縮短分析時間。
六、檢測器的選擇和校準
離子色譜常用的檢測器包括電導池檢測器（直接電導和抑制電導）、電化學檢測器（直流安培、脈沖安培和積分安培）和光學檢測器（紫外-可見和熒光）等。應根據離子的類型、性質和濃度范圍選擇合適的檢測器。電導池檢測器是最常用的檢測器，適用于大多數離子，尤其是抑制電導常為首選檢測方式。電化學檢測器通常用于能夠在電極表面發生氧化還原反應的一類離子，比如硫酸根、氰根、亞硝酸根、金屬離子等，也適用于糖類、糖醇和抗生素的分析。王彩媚等圖片建立離子色譜法同時測定阿拉伯膠經酸水解后的單糖（鼠李糖、阿拉伯糖、半乳糖）和糖醛酸（D-葡萄糖醛酸），采用的是積分安培檢測器，該方法靈敏度和準確度高、重復性良好。此外，電化學檢測器的高靈敏度也適用于抗生素的分析，如徐艷梅等[7]建立了離子色譜法測定阿奇霉素中殘留的鹽酸羥胺，采用電化學檢測器進行檢測，鹽酸羥胺的檢測限和定量限分別為0.062 ng/mL和0.207 ng/mL，具有較高的靈敏度。光學檢測器與離子色譜聯用可提高待分析物的靈敏度，比如離子色譜與紫外檢測器聯用，可進一步增強待分析物的紫外吸收能力，對于自身缺少紫外吸收的離子有較好的分析適用性和檢測靈敏度，目前在硝酸根和亞硝酸根離子的測定方面得到一定的應用。比如，甘露等圖片建立了離子色譜-紫外檢測器測定食品中亞硝酸鹽和硝酸鹽的分析方法, 亞硝酸鹽和硝酸鹽的檢測限分別為0.0045 mg/L和0.0172 mg/L，該方法簡便、靈敏，可用于測定食品中痕量的亞硝酸鹽和硝酸鹽。
無論采用何種檢測器，都應定期對其進行校準和性能測試，以確保樣品測試時準確可靠。
七、離子色譜與其他分析技術聯用
有時候單獨使用離子色譜無法滿足測試需求，此時可考慮與其他分析技術聯用，比如，采用離子色譜與ICP-MS或ICP 聯用的方法可以對一些特定元素的價態、形態進行檢測。這種檢測方式可以解決元素價態、形態問題，是單獨使用原子光譜或離子色譜無法實現的。王媛等圖片建立了IC－ICP-MS方法用于測定人體尿液中碘元素形態及含量。該方法可對圖片和I-定量測定。另外，還有研究者采用IC－ICP-MS法實現了對飲用水中三價鉻和六價鉻的含量測定圖片。離子色譜與原子光譜的聯用技術擴大了二者的應用范圍。
八、方法驗證和質量控制
與其他定量分析方法一樣，離子色譜分析方法建立后必然需要進行方法驗證，驗證指標包括專屬性、準確度、精密度、線性與范圍、耐用性等，微量和痕量分析還需驗證檢測限/定量限，具體驗證方法和要求可參照《中國藥典》四部指導原則9101、USP<1225>和ICH Q2等指南圖片。當方法驗證成功后，就可用于樣品的質量控制，基于分析方法全生命周期監控理念，后期的樣品測試過程中仍需根據測試結果持續監控方法的穩定性和可靠性。
九、結語
本文筆者從8個方面，層層遞進地闡述了一套離子色譜分析方法開發思路，意在為廣大研究者在離子色譜分析方法開發方面提供參考。離子色譜法可以彌補氣相色譜法(GC)和液相色譜法(HPLC)對離子型藥物等進行分析時的不足，也可以解決ICP或ICP-MS無法測試元素形態、價態的問題。隨著離子色譜柱種類的不斷增多，色譜柱柱效越來越好，淋洗劑種類越來越多，檢測器類型更佳豐富多樣，未來離子色譜法在藥物領域的應用范圍定會越來越廣，期待廣大研究者們開發出越來越多的離子色譜分析方法。
參考文獻
[1] 陳熠熠，趙瑜，庹蘇行，等．離子色譜法同時測 定蜂蜜中的多種糖類物質[J]．廣東化工，2015，42(8)：193-194.
[2]張燁，李靜，丁華，等．離子色譜法測定牛黃清胃丸中二氧化硫殘留量[J]．北方藥學，2021，18(11)：19-22．
[3] 王瑞萍 王燕相，肖惠峰，等. 離子色譜法測定塑料中鹵素含量的方法分析[J]. 合成材料老化與應用，2020，49(5)：48-50.
[4] 陸溱偉，劉靜雨， 李坤鵬，等. 離子色譜分析齊拉西酮原料藥中甲磺酸根離子[J]. 化學世界，2022，63(2)：100-104.
[5] 龍四紅，陳謝花，李紅洲，等. 離子色譜法測定酸湯中13種有機酸的分析方法[J]. 食品科技，2022，47(8)：256-263.
[6]王彩媚，宋粉云．離子色譜法同時測定阿拉伯膠水解后的單糖和糖醛酸[J]．今日藥學，2018，28(11)：727-729，739．
[7] 徐艷梅，韓彬，郝麗娟，等．離子色譜–電化學法測定阿奇霉素中鹽酸羥胺[J]．化學分析計量，2022，31(8)：39-43．
[8]甘露，許琳科，王佳．離子色譜－紫外檢測器測定食品中亞硝酸鹽和硝酸鹽[J]. 鹽城工學院學報(自然科學版)，2021，34(2)：74-78.
[9]王媛，劉德曄．人體尿液和血漿中碘元素形態分析方法學的研究[J]．江蘇預防醫學，2018，29(1)：1-3，60．
[10]陳光，林立，錢聰，等．離子色譜-電感耦合等離子體質譜聯用測定飲用水中的三價鉻和六價鉻[J]．農業機械，2012，2：127-130．
[11] 2020年版《中國藥典》四部指導原則9101.
[12] USP <1225>.
[13] ICH Q2.
