背景
在過去的半個(gè)多世紀(jì)里，小分子細(xì)胞毒素藥物廣泛用于治療各種惡性腫瘤，在某些臨床條件下，改變了其中一些疾病的自然進(jìn)程。但由于它們內(nèi)在的作用方式，容易引起嚴(yán)重的靶外不良事件從而妨礙其臨床療效，進(jìn)而導(dǎo)致早期停藥、腫瘤復(fù)發(fā)或復(fù)發(fā)的風(fēng)險(xiǎn)也隨之增加。例如普納替尼(ponatinib)，在一項(xiàng)名為PACE的研究中，28個(gè)月的隨訪期顯示，普納替尼增加了心臟毒性的風(fēng)險(xiǎn)，包括10%的心血管、7%的腦血管和7%的周圍不良事件[1]。
為了提高對(duì)癌癥患者的療效，科學(xué)家們研發(fā)出一種可以選擇性靶向腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞毒素藥物，以期提高化療藥物的有效性并降至最低全身毒性。在這些新穎的藥物中，結(jié)合了細(xì)胞毒性藥物的人源化抗體，即抗體偶聯(lián)藥物（Antibody-Drug Conjugate, ADC）， 躋身于癌癥科學(xué)與臨床發(fā)展的行列[2]。2000年，F(xiàn)DA首次批準(zhǔn)了用于治療成人CD33陽(yáng)性急性髓性白血病的ADC藥物：Mylotarg® (gemtuzumab ozogamicin)[3]，標(biāo)志著癌癥靶向治療藥物ADC時(shí)代的開始。2021年6月，首個(gè)國(guó)產(chǎn)ADC藥物，榮昌生物研發(fā)的維迪西妥單抗獲批上市。ADC藥物技術(shù)一直在迅速發(fā)展，截止目前，全球共有15款A(yù)DC藥物獲批上市，有200多款A(yù)DC藥物正在進(jìn)行臨床試驗(yàn)。大多數(shù)ADC藥物已從I期進(jìn)展到II期，部分ADC藥物的III期試驗(yàn)顯示出積極的結(jié)果。這個(gè)新興的化療分子藥物被視為最有效的抗癌治療劑之一，預(yù)計(jì)在不久的將來會(huì)顯著增加它的市場(chǎng)份額[4]。
什么是ADC
ADC是指通過連接子將小分子化合物偶聯(lián)至靶向性抗體或抗體片段的一類生物技術(shù)藥物，其結(jié)構(gòu)組成包括抗體或抗體片段（Antibody），連接子（Linker），具有細(xì)胞毒性的小分子化合物（Payload）（圖1）。其中，抗體通常選用可被靶細(xì)胞內(nèi)化的抗體；連接子具有一定的循環(huán)穩(wěn)定性，可以支持藥物在到達(dá)靶器官前不被降解或者少量降解，進(jìn)入細(xì)胞后能夠快速釋放活性小分子化合物；小分子化合物能夠?qū)Π屑?xì)胞產(chǎn)生藥效作用。因此，ADC是生物大分子和化學(xué)小分子的結(jié)合體，具有獨(dú)特的作用機(jī)制和代謝動(dòng)力學(xué)特征[4]。
圖1：ADC結(jié)構(gòu)，圖片引自[4]
ADC的作用機(jī)制及其優(yōu)勢(shì)
ADC藥物中的單克隆抗體表現(xiàn)出選擇性附著和進(jìn)入抗原過度表達(dá)的癌細(xì)胞的能力。ADC藥物隨后通過一系列細(xì)胞內(nèi)化過程被帶入腫瘤細(xì)胞內(nèi)，這一過程從早期含體形成開始，發(fā)展到晚期內(nèi)含體的成熟，并最終與溶酶體融合。ADC的有效載荷在溶酶體內(nèi)通過化學(xué)或酶作用發(fā)生裂解，釋放后，這種有效載荷通過破壞目標(biāo)細(xì)胞內(nèi)的DNA或微管發(fā)揮其細(xì)胞毒性，最終導(dǎo)致癌細(xì)胞的死亡（圖2）。此外，如果釋放的有效載荷具有透過細(xì)胞膜的能力，它還能引發(fā)“旁觀者效應(yīng)”，即不需要ADC的內(nèi)化作用就能引起鄰近的靶細(xì)胞發(fā)生凋亡。因此，由于ADC藥物精準(zhǔn)的抗體結(jié)合和有效載荷的促凋亡能力，它在癌癥治療方面具有多種優(yōu)勢(shì)，包括治療窗口及療效增強(qiáng)，耐藥性降低，癌細(xì)胞特異性靶向，對(duì)正常細(xì)胞的毒性相對(duì)較低，與傳統(tǒng)化學(xué)癌癥治療相比，副作用較小等[5]。
圖2：ADC的作用機(jī)制，圖片引自[5]
ADC的PK生物分析策略
ADC進(jìn)入體內(nèi)后，payload可通過酶解或者化學(xué)反應(yīng)從主體結(jié)構(gòu)上逐漸解離，主要包括偶聯(lián)抗體、抗體偶聯(lián)藥物、總抗體、裸抗、游離的小分子payload以及payload相關(guān)的代謝產(chǎn)物等。他們?cè)隗w內(nèi)的濃度變化對(duì)解讀ADC的PK藥代動(dòng)力學(xué)特點(diǎn)至關(guān)重要。ADC為抗體或抗體片段至少結(jié)合一個(gè)payload（抗體偶聯(lián)比（Drug to antibody ratio，DAR）≥1）；總抗體為未偶聯(lián)和偶聯(lián)至少一個(gè)payload分子的抗體的總和（DAR≥0）；Payload為ADC裂解或被分解代謝后形成的游離的payload，在FDA于2022年2月發(fā)布的“Clinical Pharmacology Considerations for Antibody-Drug Conjugates”指導(dǎo)原則草案中指出，在對(duì)ADC藥物進(jìn)行生物分析時(shí)，應(yīng)該測(cè)定多種生物分析物用于評(píng)估ADC暴露量，例如：體內(nèi)的總抗體含量、ADC含量以及小分子payload部分和藥理活性代謝產(chǎn)物的含量[6][7]。目前已經(jīng)上市的ADC藥物的PK檢測(cè)主要包括總抗體、ADC和小分子化合物部分。一般總抗體和ADC的檢測(cè)主要在LBA平臺(tái)開展，小分子化合物部分在LC-MS平臺(tái)進(jìn)行。本篇主要對(duì)在LBA平臺(tái)開展ADC的PK檢測(cè)展開討論。
對(duì)于總抗體和ADC部分的檢測(cè)，通常采用ELISA或MSD平臺(tái)。針對(duì)總抗體，通常利用靶點(diǎn)或抗裸抗的特異性抗體作為捕獲試劑進(jìn)行包被，再選擇酶標(biāo)的抗裸抗特異性抗體或普抗作為檢測(cè)抗體進(jìn)行檢測(cè)（圖3A）。針對(duì)ADC，通常利用抗payload特異性抗體作為捕獲抗體進(jìn)行包被，再選擇酶標(biāo)的抗裸抗特異性抗體、普抗或者靶點(diǎn)作為檢測(cè)抗體進(jìn)行檢測(cè)（圖3B）。以已上市的ADC藥物Enhertu為例，它的主體是抗Her2抗體，有效載荷為Dxd，該上市藥物的PK檢測(cè)中，總抗體和ADC的檢測(cè)是在ECL平臺(tái)進(jìn)行的，總抗體的檢測(cè)中分別使用anti-HER2 antibody的特異性單克隆抗體作為捕獲試劑和檢測(cè)試劑，而ADC的檢測(cè)中使用抗小分子抗體anti-Dxd antibody作為捕獲抗體，檢測(cè)抗體則使用測(cè)的是anti-HER2 antibody的單克隆抗體。
圖3：總抗體和ADC的PK生物分析，圖片引自[8]
ADC的PK生物分析挑戰(zhàn)
由于ADC自身所具有的特殊結(jié)構(gòu)和復(fù)雜的組分多樣性，其PK生物分析方法的建立具有很大的挑戰(zhàn)性，本篇主要針對(duì)在LBA開展的ADC的PK檢測(cè)展開討論，在LBA平臺(tái)進(jìn)行ADC的檢測(cè)時(shí)主要有以下幾個(gè)挑戰(zhàn)：（1）DAR值敏感性，當(dāng)ADC進(jìn)入體內(nèi)后，payload可通過酶解或者化學(xué)反應(yīng)從主體結(jié)構(gòu)上逐漸解離，產(chǎn)生不同DAR值的ADC藥物，而ADC標(biāo)準(zhǔn)品往往不能準(zhǔn)確的反應(yīng)體內(nèi)ADC藥物的真實(shí)情況，尤其是PK靠后的一些采樣時(shí)間點(diǎn)樣本[9]，另外不同DAR值的ADC藥物與捕獲試劑或者檢測(cè)抗體的結(jié)合能力可能不同，影響總抗體和ADC濃度的準(zhǔn)確度測(cè)定，尤其體現(xiàn)在一些高DAR值的ADC和低DAR值的ADC藥物間。（2）小分子毒素結(jié)構(gòu)的改變，目前在研的小分子毒素主要有DNA損傷劑、DNA轉(zhuǎn)錄抑制劑、微管蛋白抑制劑、美登素、喜樹堿類、Tubulysin B類似物等，其化學(xué)結(jié)構(gòu)可能會(huì)隨著藥物在體內(nèi)的生物轉(zhuǎn)化和分解代謝而發(fā)生改變，從而也帶來它獨(dú)特的生物分析挑戰(zhàn)。例如，像喜樹堿類的衍生物，作為DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶I的抑制劑，分子中的內(nèi)酯環(huán)，是主要的活性基團(tuán)，但結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定，在pH上升時(shí)會(huì)打開，打開后的結(jié)構(gòu)會(huì)改變和抗體之間的結(jié)合能力，從而影響PK的檢測(cè)[10]；另外有些小分子毒素在體內(nèi)會(huì)發(fā)生轉(zhuǎn)化，PK的檢測(cè)形式也會(huì)增多，例如ADC藥物MEDI4276，臨床的PK檢測(cè)包含了總抗體，小分子毒素轉(zhuǎn)化前后的ADC，游離的轉(zhuǎn)化前后的小分子毒素5種形式[11]。（3）可溶性靶點(diǎn)蛋白，當(dāng)循環(huán)系統(tǒng)中有高濃度游離的可溶性靶點(diǎn)蛋白時(shí)，可能會(huì)影響抗原或者是特異性抗體和藥物的結(jié)合效率，從而對(duì)PK的檢測(cè)帶來一定的影響。（4）抗藥抗體，當(dāng)體內(nèi)有抗藥抗體或者是中和抗體產(chǎn)生時(shí)，都會(huì)對(duì)PK的檢測(cè)帶來影響，抗藥抗體可能會(huì)帶來空間位阻的影響，而中和抗體會(huì)直接影響抗原或者特異性抗體和藥物的結(jié)合。
DAR敏感性考量
藥物抗體偶聯(lián)比（drug-to-antibody ratio, DAR）是指一個(gè)抗體所攜帶payload數(shù)量的平均值，是ADC最重要的質(zhì)量屬性之一，因?yàn)檫@決定了可以輸送到腫瘤的“有效載荷”，可以直接影響安全性和有效性。較低的DAR會(huì)降低ADC的效力，但過高的DAR又會(huì)影響ADC分析的藥代動(dòng)力學(xué)和毒性。ADC藥物的DAR值通常為0到8之間，普遍認(rèn)為DAR在3-4之間是ADC藥物的最優(yōu)選擇[12]。
ADC進(jìn)入體內(nèi)后，連接子可能由于酶解或其他的作用發(fā)生斷裂，使得payload從主體結(jié)構(gòu)上逐漸解離，產(chǎn)生不同形式的ADC。以DAR8的ADC為例，在進(jìn)入人體內(nèi)后可產(chǎn)生DAR6、DAR4、DAR2等形式的ADC。不同DAR的ADC分子可能會(huì)有不同的清除率[12]，所以隨著給藥時(shí)間的推移，不同訪視點(diǎn)采集的樣本中ADC的DAR值分布可能會(huì)有很大的不同，尤其是在給藥周期比較靠后的時(shí)間點(diǎn)。因此在建立PK生物分析方法的時(shí)候，需要考慮檢測(cè)方法對(duì)不同DAR形式的ADC的敏感性，即無論ADC在體內(nèi)以何種DAR的形式存在，都能準(zhǔn)確的被檢測(cè)到。
首先對(duì)于ADC的檢測(cè)，可以使用靶點(diǎn)蛋白作為捕獲試劑，抗小分子毒素的抗體作為檢測(cè)試劑，也可以使用抗小分子毒素的抗體作為捕獲試劑，使用靶點(diǎn)蛋白作為檢測(cè)試劑，往往后者在DAR敏感性測(cè)試中有比較好的結(jié)果，圖4是在一款A(yù)DC的PK檢測(cè)中使用2種不同assay format在DAR敏感性中的差異。從圖中可以看出，當(dāng)使用靶點(diǎn)蛋白作為捕獲試劑，抗小分子毒素的抗體作為檢測(cè)試劑時(shí)，隨著DAR值的降低，QC的回收率也隨之降低；當(dāng)使用抗小分子毒素的抗體作為捕獲試劑時(shí)，不同DAR值的ADC間的QC差異較小，整體的回收率都在80%-120%之間。這和文獻(xiàn)中的報(bào)道也比較一致，在ADC的檢測(cè)中建議使用抗小分子藥物的抗體作為包被試劑，不同ADC間檢測(cè)的結(jié)果更加一致。
圖4：ADC檢測(cè)中不同assay format下不同DAR值A(chǔ)DC樣品的回收率
在另一款A(yù)DC的檢測(cè)中，使用抗小分子毒素的抗體作為捕獲試劑，使用抗ADC抗體部分的單克隆抗體作為檢測(cè)試劑，不同的包被抗體濃度下，不同DAR值的ADC樣本間檢測(cè)差異也顯著不同，見圖5，當(dāng)包被濃度為1.0 ug/ml時(shí)，DAR=2時(shí)的ADC樣本在高濃度，中濃度和低濃度質(zhì)控樣本間的回收率都偏低，低于方法中80%-120%的接收標(biāo)準(zhǔn)，隨著包被濃度的提高，低DAR值的ADC樣本間的回收率逐漸提高，當(dāng)包被濃度提高到2.5 ug/ml時(shí)，不同DAR值的ADC樣本間檢測(cè)的結(jié)果較一致。
圖5: ADC檢測(cè)中不同包被濃度下不同DAR值樣本的回收率
另外在總抗體的檢測(cè)中，可以使用靶點(diǎn)蛋白作為捕獲試劑，通用性抗體作為檢測(cè)試劑，但這種assay format情況下，可能會(huì)出現(xiàn)裸抗的檢測(cè)結(jié)果遠(yuǎn)高于總抗體的情況，如圖6中的案列，當(dāng)使用靶點(diǎn)蛋白作為捕獲試劑時(shí)，裸抗樣本的回收率整體遠(yuǎn)高于總抗體，并且回收率大多超出方法規(guī)定的接收標(biāo)準(zhǔn)（圖6左），當(dāng)將靶點(diǎn)蛋白調(diào)整為特異性更好的抗體時(shí)，總抗體和裸抗的檢測(cè)結(jié)果比較一致（圖6右）。
圖6: 總抗體檢測(cè)中不同包被試劑在總抗體和裸抗之間的差異
結(jié)語(yǔ)
ADC藥物由于自身的特殊結(jié)構(gòu)和復(fù)雜的組分多樣性，給PK的生物分析方法建立帶來很大的挑戰(zhàn)，開發(fā)一款準(zhǔn)確而穩(wěn)定的ADC生物分析方法對(duì)藥代動(dòng)力學(xué)的研究至關(guān)重要，一般總抗體和ADC的檢測(cè)在LBA平臺(tái)展開，小分子化合物的檢測(cè)在LC-MS平臺(tái)開展。在LBA平臺(tái)開發(fā)ADC的PK檢測(cè)一般需要考慮DAR值敏感性、靶點(diǎn)干擾、小分子毒素帶來的影響之外，也需要關(guān)注總抗體和ADC檢測(cè)濃度之間的關(guān)系。
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