近年來，小核酸藥物因特異性強、設計簡便、研發周期短、靶點豐富等優點，成為當前生物醫藥領域研究的熱點；小核酸藥物的重點是清除與遺傳疾病相關的某些蛋白質，它主要是針對靶基因，而大多數小分子藥物并不是針對靶基因。小核酸藥物專指靶向作用于RNA或蛋白質的一類寡核苷酸分子，包括反義寡核苷酸（ASO）、siRNA、aptamer等，反義寡核苷酸（ASO）通常是由15~25個核苷酸組成，并且進行了某些化學修飾的短鏈核酸，它的堿基通過（watson-crick）堿基互補配對原則與靶標形成雙鏈結構。siRNA 是生物宿主對外源侵入基因表達的雙鏈RNA 進行切割所產生的具有特定長度（21-25bp）和特定序列的小片段RNA，小干擾 RNA被發現以來一直廣泛認為能夠沉默許多或所有基因的核糖核酸。
雖然小核酸藥物可以針對大部分小分子無法達到的靶標，但它也會面臨很大的挑戰。第一，小核酸藥物很容易被體內的核酸酶降解，據研究顯示，未修飾或未被封裝的小核酸藥物的半衰期僅10min；第二，小核酸藥物缺乏靶向性以及存在脫靶效應，這就可能導致嚴重的副作用，進一步限制了給藥劑量以及治療效果；第三：小核酸藥物自身攜帶負電荷，且分子量較高，而細胞膜通常也是帶負電荷，由于同種電荷的相互排斥，導致分子很難通過細胞膜進入細胞；第四：內化進入細胞膜中的小核酸藥物，又容易被內吞體和酸性溶酶體的微環境，清除出去；這些因素共同導致小核酸藥物難以進入細胞核，達到靶基因。
針對這些挑戰，科學家們主要通過這幾種方法對藥物進行改進，第一：通過對寡核苷酸藥物的結構修飾，增強藥物的酶抗性；第二：通過遞送系統，提高藥物的靶向性，遞送系統又分為兩種（化學偶聯以及脂質納米顆粒），這兩種方法目前比較成熟，且已有產品上市；第三：通過緩釋系統延長藥物的半衰期，比如水凝膠、納米聚合物、微針等；下面將重點介紹持續遞送寡核苷酸的方法進行綜述。
水凝膠
與脂質納米遞送或化學偶聯相比，水凝膠在RNA領域應用還處于早期階段，水凝膠主要是通過吸收水分溶脹成三維網絡，而負載在水凝膠中的RNA可以通過物理化學相互作用直接包裹，也可以將RNA封裝于納米載體后加載至水凝膠中。相比之下，RNA先封裝于納米載體后，RNA的生物活性、釋放行為以及特定細胞的靶向性更好。下面是RNA水凝膠的臨床前研究時間表以及該技術主要應用的疾病領域。
圖 1：最近基于水凝膠的 RNA 遞送的臨床前研究的時間表（Zhong[1]等, 2023）
橙色為癌癥治療，藍色為用于骨再生，黃色為免疫治療，紅色為心臟修復，灰色為血管生成
圖2 基于水凝膠的 RNA 遞送的生物醫學應用（Zhong1 等, 2023）
RNA水凝膠分為外用和可注射用水凝膠；外用的水凝膠材料主要有：明膠、殼聚糖、海藻鹽、膠原蛋白、聚乙烯醇（PVA）、羥乙基纖維素、聚(N-異丙基丙烯酰胺)(PNIPAM)等材料。然而在早期研究過程中發現，單獨采用天然性凝膠材料，藥物存在細胞傳染性問題，因此后來大多數研究都是采用合成的陽離子聚合物，比如：將陽離子聚乙烯亞胺（PEI）、聚賴氨酸（PLL）等滲入凝膠中，通過帶有陽離子的聚乙烯亞胺（PEI）與帶有負電荷的siRNA結合，可以延長siRNA的釋放、提高藥物的傳染效果、提高藥物的包封率；
注射用的水凝膠材料主要有：經過修飾的環糊精、聚(乙二醇)二丙烯酸酯（PEG-DA）纖維蛋白以及通過化學修飾的一些新型材料。據文獻報道[2]（Attias Cohen 等, 2022），將反義寡核苷酸與PEI結合，形成納米復合物，然后將反義寡核苷酸的PEI復合物加載到聚(乙二醇)二丙烯酸酯（PEG-DA）纖維蛋白中，通過紫外照射形成水凝膠微球，肌肉注射后，藥物釋放時間可以達到21天，對小鼠成肌細胞無毒，將AON負載的PF微球肌肉注射到MDX小鼠的TA肌中，結果顯示組織炎癥減少，纖維大小的均勻性改善，30天后纖維化減少。
據另一項研究報道3，韓國科技技術研究所制備了一種可注射的具有可裂解酯鍵的熱敏陽離子聚合物-低分子量聚乙烯亞胺聚（有機磷腈）共軛物，該共軛物可以與siRNA形成100nm的多聚物，該多聚物在體溫環境下通過疏水作用轉為多聚物水凝膠，藥物通過該聚合物的溶解和降解從水凝膠中緩慢釋放，可以實現長達4周的基因沉默。
圖3 水凝膠（[3]Kim 等, 2012）
微球
2004年khan等人將寡核苷酸藥物包封在微球中，給藥后7天寡核苷酸依然在給藥部位，聚合物釋放的寡核苷酸與游離寡核苷酸有相似的生物分布，大部分集中在腎臟的近曲小管和肝臟，這些發現表明，可生物降解的PLGA微球提供了一種改善寡核苷酸體內遞送的方法，根據該篇文獻得知，皮下注射封裝寡核苷酸藥物的微球，在注射部位停留時間較長，而且它的劑量是裸寡核苷藥物的一半，但是，該文獻年代久遠，未見更新的文獻，可能其中還存在較多問題待解決；
圖4 微球在小鼠體內的（[4]Khan 等, 2004）
在2024年，加拿大滑鐵盧大學的科研團隊將siRNA與PEI結合后形成納米復合物，然后將siRNA-PEI納米復合物包裹至PEG-PLGA形成微球，然后再將微球制備成含有聚乙烯醇的凝膠中，用于陰道給藥，使得藥物在陰道中釋放時間可以長達15天以上，并能夠顯著減少HIV病毒復制高達73%。
納米球
納米球是嵌段共聚物的自組裝體，具有作為納米級治療遞送劑的巨大潛力，與脂質體相比，納米球具有許多優點，例如受控和持續的藥物或基因釋放、穿透組織的能力和降低的毒性。
圖5.納米聚合物（[5]Xiang 等, 2017）
Tabata 及其同事還開發了細胞內 siRNA 持續遞送系統，以延長基因抑制的時間，使用丙酮將明膠水溶液與熒光素酶 siRNA 凝聚，然后用戊二醛 (GA) 交聯明膠，制備帶有 siRNA 的明膠納米球，為了釋放納米球中的 siRNA，納米球在含有膠原酶的 PBS 溶液中隨時間降解。隨著 GA 濃度的增加，納米球降解速率降低，從而 siRNA 釋放速率降低。帶有siRNA的納米球延長了基因抑制的時間，從而實現了siRNA的持續釋放。
提到納米球，我們有必要談一談脂質納米粒，雖然未見相關報道，證明該項技術具有緩釋作用，但該項技術具有很好的遞送作用，可以有效的降低藥物的劑量，因此下面我們來聊一聊脂質納米粒（LNP）。
脂質納米顆粒（LNP）是一種通過對天然和人工脂質材料進行全面篩選，專門為核酸藥物遞送而優化的脂質體。通常來說，LNP由4種組分構成，包含（1）可電離陽離子脂質、（2）磷脂、（3）膽固醇和（4）聚乙二醇(PEG)脂質。每種成分均決定LNP的穩定性、轉染效率和安全性方面起著至關重要的作用；其制備方法如下：將乙醇-脂質混合物與含有寡核苷酸藥物的酸性緩沖液（pH 4~5）按一定比例，通過微流控裝置進行混合，實現自組裝。
組裝過程中，可電離陽離子脂質首先被質子化并帶正電荷，通過靜電吸附作用與帶負電荷的核苷酸藥物結合。同時，其它輔助脂質包括磷脂、膽固醇、PEG脂質在這之上進一步組裝，形成穩定的LNP-mRNA。隨后，通過緩沖液交換將mRNA-LNP溶液透析到PBS緩沖液(pH 7.4)中，去除未包封的mRNA、多余的脂質和乙醇，并調整到中性pH，使可電離脂質不帶電，在生理pH下更加穩定且毒性更小。
圖6 LNP技術的常用輔料[6]
在該處方中，可電離陽離子脂質是LNP的關鍵成分，其酸解離常數（pKa）決定LNP的電離行為和表明電荷，并進一步影響LNP的穩定性和毒性。磷脂是幫助脂質納米顆粒自組裝和內涵體逃逸的輔助脂質，在臨床前研究和臨床應用中，常用的磷脂是DSPC和DOPE，膽固醇有助于增加LNPs的穩定性，并幫助細胞膜融合，優化膽固醇的結構也可以提高LNPs的遞送效率并賦予LNPs特定的功能。聚乙二醇(PEG)脂質主要作用于減少納米顆粒聚集，減少單核吞噬細胞吞噬，延長系統循環時間。然而PEG脂質也會阻礙于靶細胞的相互作用和內涵體逃逸，降低轉染效率。
LNP的釋放機制，根據文獻報道，采用LNP-siRNA吸收機制主要是依靠體內的載脂蛋白E（apoE）和低密度脂蛋白（LDL）受體，中性的LNP吸附體內的載脂蛋白E，進而被肝細胞攝取，攝取進入肝細胞后，由于內涵體呈現酸性環境，因此中性的LNP進而變成正電荷，帶負電荷的核酸藥物從內涵體中逃脫出來，最后到達目的。
ASO應用LNP需要注意的幾個點：第一：siRNA和mRNA為雙鏈，而ASO為單鏈，其結構中的磷酸二脂鍵主鏈可能會與LNP相互作用，換句話說，ASO結構中的序列和堿基結構可能會影響LNP的性質，有可能會造成性質不穩，根據文獻[7]得知，采用可電離脂質體ssPalmO分別對siRNA,mRNA以及ASO進行包封，兩者的組成成分有一定的差異，其中包封siRNA時，其ssPalmO/膽固醇=70：30，而采用該處方包裹ASO發現LNP非常不穩定，LNP容易聚集，為了穩定，該研究團隊將處方比例進行修改，處方組成比例修改為ssPalmO/DOPC/膽固醇=40/20/40，并添加1.5%的DMG-PEG2000，ASO濃度為25 nmol/µg。第二，LNP的吸收機制可能同樣適用于ASO-LNP；第三，脂質體的穩定性以及粒徑也是藥物吸收的關鍵因素。
圖7 ssPalmO結構式（[7]Tanaka等, 2021）
綜上所述，采用持續遞送小核酸藥物的方法大部分都處于早期階段，且需要解決藥物的細胞傳染力，提高藥物的包封率，同時還需要借助一些新型材料。
參考文獻：
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[3]Kim Y-M, Park M-R, Song S-C. Injectable Polyplex Hydrogel for Localized and Long-Term Delivery of siRNA[J]. ACS Nano, 2012, 6(7): 5757–5766.
[4]Khan A, Benboubetra M, Sayyed P Z, 等. Sustained Polymeric Delivery of Gene Silencing Antisense ODNs, siRNA, DNAzymes and Ribozymes: In Vitro and In Vivo Studies[J]. Journal of Drug Targeting, 2004, 12(6): 393–404.
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