前言：這個主題，是關(guān)于藥物晶體中微量無定型的定量分析，微量無定型定量特指無定型含量＜10%情況下的定量分析。藥物為什么要做晶型中微量（＜10%）無定型的定量呢?因為制劑處理過程（如微粉化、粉碎、凍干、噴霧干燥、研磨和壓片），會導(dǎo)致晶體中產(chǎn)生不同程度的無定型，并且產(chǎn)生的無定型主要吸附在晶體表面，影響晶體的表面性能，從而會嚴重影響產(chǎn)品的后處理和藥物的穩(wěn)定性。目前行業(yè)內(nèi)，做晶型中微量無定型定量的品種，主要集中在吸入粉霧劑品種如“茚達特羅”。
1、 分析檢測手段
分析方法的開發(fā)，主要考察的是靈敏性、專屬性、檢測限和定量限。不同檢測手段的定量限LOQ和檢測限LOD及特點匯總列于表1。目前來說，晶體中微量無定型的檢測，行業(yè)內(nèi)檢測精度較高且公認的方法有：恒溫量熱儀isothermal microcalorimetry (IMC)； solution calorimetry (SC),固態(tài)核磁(ssNMR)和動態(tài)水分吸附儀dynamic vapor sorption (DVS)。對于藥企來說，這四種檢測手段中，最可及的檢測手段是動態(tài)水分吸熱儀（DVS），因此本文主要介紹如何利用DVS做無定型定量方法開發(fā)。
表1 無定型定量的分析檢測手段及精度匯總表
2、 DVS定量分析的三種方法
DVS用于無定型定量的分析，主要有三種方法，概述如下：
方法一（Method 1）：平衡吸濕法（Equilibrium Moisture Uptake Method）
原理：測定晶型、無定型、二者混合物的平衡吸濕增重的量；在較寬的無定型比例范圍內(nèi)，平衡吸濕增重與無定型含量呈線性關(guān)系。
方法適用性：適用于滿足以下條件的情形—a，無定型在重結(jié)晶前，樣品有較大量吸收增重；b，無定型在選擇的實驗條件下不發(fā)生轉(zhuǎn)晶（如下圖1所示）。
圖1 適合選擇方法一的典型吸附曲線示意圖
平衡吸濕法的檢測限受限于選定條件下樣品的吸濕增重的量，換句話說，質(zhì)量變化越大，選擇平衡吸濕法做定量分析的準確度越高。
方法二（Method 2）：吸收法（Water-Solvent Uptake Method）
原理：恒定濕度下，比較無定型轉(zhuǎn)晶前后的重量變化。前后吸濕重量差和無定型含量呈現(xiàn)線性關(guān)系。
方法適用性：在特定溶劑氛圍濕度下無定形能重結(jié)晶形成晶體的情形。
方法二開發(fā)的流程相對復(fù)雜一些，但精度更高，具體如下：
（1）測定純無定型樣品吸附曲線（moisture sorption profile）
下圖2是無定型轉(zhuǎn)晶的典型的吸附曲線，RH≥60時，無定型發(fā)生轉(zhuǎn)晶變成晶體，吸附曲線出現(xiàn)轉(zhuǎn)折。這里需要強調(diào)的是，DVS不單單是只能做水分吸附，也可以開發(fā)有機溶劑吸附的方法。根據(jù)Gordon-Taylor(G-T)公式，水分或者惰性溶劑都是良好的增塑劑（如水的玻璃化轉(zhuǎn)變溫度136K，乙醇和丙酮大約為100K），無定型吸收水分或者溶劑后，玻璃化轉(zhuǎn)變溫度降低，從而發(fā)生轉(zhuǎn)晶。總而言之，開發(fā)方法的第一步，是需要尋找合適的測試溫度和誘導(dǎo)溶劑氛圍，使得純無定型在選定條件下發(fā)生轉(zhuǎn)晶。
圖2 無定型濕度介導(dǎo)轉(zhuǎn)晶示意圖
（2）臨界濕度點的確定（Critical Point）
臨界濕度點定義：在選定條件下，無定型發(fā)生轉(zhuǎn)晶的濕度點。上圖1中臨界濕度點為60%。在臨界濕度點前，無定型既有表面吸附（adsorption）也有主體吸收（absorption），無定型轉(zhuǎn)換為晶體后，晶體只有表面吸附，這也是圖1曲線出現(xiàn)引濕增重轉(zhuǎn)折點的根本原因。圖2給出了表面吸附和主體吸收的示意圖。
圖2 表面吸附和主體吸收的示意圖
（3）參考濕度點確定（Reference point）
Reference point是指選定用于測試的濕度點。它需要選擇在無定型轉(zhuǎn)晶前，并盡可能選擇吸濕增重較大的濕度點。如文獻2中，轉(zhuǎn)晶濕度點RH=60%，選擇參考濕度點RH=45%。
（4）樣品測試及標準曲線繪制
配置不同比例的混合物（無定型+晶型）樣品，按類似圖3所示方法測試DVS引濕增重：
Step I：RH-=0% 干燥至恒重；
Step II：RH=45%（reference point ）足夠時間得到吸附吸收平衡；
Step III：RH-=0% 干燥至恒重；
Step IV：RH>臨界濕度 足夠時間無定型發(fā)生完全轉(zhuǎn)晶；
Step V：RH-=0% 干燥至恒重；
Step VI：RH=45%（reference point ）足夠時間得到吸附吸收平衡；
以Step II和Step VI重量差為縱坐標，無定型含量為橫坐標，做圖即可的如圖4所示是標準曲線。
Method 2的優(yōu)點：精確度較高，因為直接測定無定型的參數(shù)，但如果開發(fā)的方法不合適，無定型轉(zhuǎn)晶不完全，則可能導(dǎo)致該方法的定量精度大大折扣。
圖3 Method 2測試方法示意圖
圖4 Method 2 標準曲線繪制示意圖
方法三（Method 3）：剩余重量法（Residual Weight Method）
原理：低濕度下的吸附脫附差值（如圖4紅色圈所示）與無定型含量呈線性關(guān)系。無定型轉(zhuǎn)晶前，在DVS條件下有表面吸附和主體吸收，當(dāng)轉(zhuǎn)晶形成計量化學(xué)比的水合物或者溶劑化物晶體后，進行脫附過程，進入晶格內(nèi)部的計量化學(xué)比的溶劑（或水）不會脫除，那低濕度下的吸附脫附差值僅僅與無定型含量相關(guān)，因此可以用來做定量。
方法適用性：無定型在選定的測試條件下，必須能形成計量化學(xué)比的化合物或者水合物，所以應(yīng)用相對受限。
方法3的開發(fā)流程與方法2類似。這里不做贅述。該方法精度同樣較高，但需要保證無定型在特定濕度下下完全轉(zhuǎn)晶為計量化學(xué)比的溶劑化物。
圖5 Method 3 測試方法示意圖
3、 DVS定量分析方法選擇的決策樹
上面介紹了DVS進行無定型定量的三種方法，其中Method 2和3精度更高，但每種方法均有各自的適用性。下圖給出了具體選擇哪種方法的決策樹。
圖6 DVS無定型定量方法選擇決策樹
4、 DVS做無定型定量的注意點
據(jù)文獻報道，DVS分析方法對于1%以下含量的樣品精度也較高，檢測限最低能做到0.05%。那DVS分析方法開發(fā)中，有哪些注意點呢？
（1）溫度
溫度越高，吸濕會增加（反例很少），低含量的無定型，吸濕很低，因此需要評估吸附受溫度影響的大小；此外對于Method 2和3，都需要無定型能發(fā)生轉(zhuǎn)晶過程，對于轉(zhuǎn)晶來說，溫度控制也是關(guān)鍵參數(shù)。總之，需要對DVS測試的溫度進行選擇。
(2) 平衡時間：（Equilibration Time）
平衡時間太短，吸附可能未達到平衡，也可能導(dǎo)致轉(zhuǎn)晶不徹底；平衡時間太長，浪費設(shè)備資源。因此平衡時間也需要優(yōu)化方法。下圖7是平衡時間對吸附影響的一個案例，可以通過吸附-脫附間隙定性判斷平衡時間是否合適。吸脫附間隙不單受平衡時間的影響、還和藥物粉末的多孔性、無定型含量和是否形成計量比的溶劑化物有關(guān)，需要根據(jù)具體情況做好甄別。
圖7 平衡時間對吸脫附“間隙”的影響
(3) 定量用標準品的預(yù)處理
100%晶型標準品理想情況下，需要與粉碎后API具有相同的理化性質(zhì)（這里主要指粒度、形貌和表面特性）。所以一般采用粉碎后（微粉化、球磨等）晶體樣品進行預(yù)處理后作為100%晶型標準品。預(yù)處理操作是：將微粉化樣品放置在特定溶劑氛圍下（如90%丙酮）使無定型樣品充分轉(zhuǎn)晶形或者消除表面晶體缺陷。
100%無定型一般也做對應(yīng)粉碎處理，然后用XRD/DSC/紅外/拉曼等表征，一般需要現(xiàn)配現(xiàn)用。對于DSC測試玻璃化轉(zhuǎn)變溫度較高的無定型（穩(wěn)定性較好的無定型），一般放在P2O5干燥器，盡量低溫保存。無定型標準品測試前，需要預(yù)干燥，一般放置25℃/RH=0%的干燥器中。
（4）裝樣量及樣品粒度
DVS定量測試，裝樣量需固定。理論上，引濕增重>10%,5-10mg的裝樣量做定量就夠；引濕增重<0.5% 推薦更大量的裝樣量50mg±5mg。裝樣樣品要求盡量平鋪，最大化的暴露比表面積。
樣品的粒度，更傾向于用小粒度做定量，且無定型和晶體有相似的幾何參數(shù)（粒度和比表面積），形貌和粒度對于Method 1的影響最大，Method 2和Method 3方法的敏感度相對會小一點。
小結(jié)：DVS無定型定量，開發(fā)最優(yōu)的參數(shù)條件，無定型定量的檢測限和定量限可以做到很低。另外，DVS測試不需要樣品均勻混合（直接計算標準品比例對應(yīng)稱量質(zhì)量即可），用樣量低，筆者推測行業(yè)內(nèi)會越來越多的使用。
本文是筆者根據(jù)文獻及經(jīng)驗整理的總結(jié)，難免有紕漏，望不吝指出。
參考文獻
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