1. 背景
抗體類藥物是一種由抗體物質(zhì)組成的藥物，是屬于生物藥的一個(gè)大的類別。抗體類藥物生產(chǎn)工藝及過程有別于傳統(tǒng)化學(xué)藥品，含有一些傳統(tǒng)工藝中沒有的雜質(zhì)，一般歸為兩類，即產(chǎn)品相關(guān)雜質(zhì)和工藝相關(guān)雜質(zhì)，其中產(chǎn)品相關(guān)雜質(zhì)有抗體的氧化和脫酰胺形式、高分子量聚集體和低分子量降解片段等，工藝相關(guān)雜質(zhì)有HCP、HCD、protein A殘留等，這些雜質(zhì)會(huì)影響最終藥品的安全性和有效性，需通過多個(gè)維度對(duì)其分子進(jìn)行表征分析（如圖1）才能確保其有效性、安全性和一致性[2,3]。
圖1 主要表征分析技術(shù)
因此，本文就抗體類藥物相關(guān)雜質(zhì)及相應(yīng)分析方法作一探討，以期為該類藥物相關(guān)檢定提供參考。
2. 抗體類藥物質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的相關(guān)規(guī)定
目前，抗體類藥物質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)相關(guān)規(guī)定主要參照《中國藥典》三部（2020版）、《中國藥典》四部（2020版）通則、WHO相關(guān)定義與要求、人用藥物注冊(cè)技術(shù)要求國際協(xié)調(diào)會(huì)議（ICH）對(duì)生物技術(shù)產(chǎn)品、生物制品及生物類似藥的相關(guān)規(guī)定、FDA和《美國藥典》的相關(guān)技術(shù)指南、歐洲藥品管理局（EMA）相關(guān)技術(shù)規(guī)范制定。
3.抗體類藥物的檢定
3.1 物理檢查
抗體類藥物是經(jīng)細(xì)胞表達(dá)、純化和制劑工藝后獲得的。不同的制劑工藝、配方、存儲(chǔ)及運(yùn)輸條件均會(huì)影響其分子間及分子內(nèi)部共價(jià)鍵和非共價(jià)鍵的形成或打開，從而改變抗體類藥物的性狀與理化性質(zhì)，并最終影響抗體藥物中蛋白低聚物(Oligomers，一般指30個(gè)以下單體分子聚合)、聚體(Aggregates)或片段(Fragments)的產(chǎn)生。
隨著分散系物理化學(xué)狀態(tài)的變化，當(dāng)形成聚體的分子增加時(shí)，導(dǎo)致聚體直徑越來越大，逐漸形成亞可見顆粒甚至可見顆粒；當(dāng)抗體分子斷裂成片段或其糖鏈發(fā)生降解。可能導(dǎo)致溶液顏色變深。如圖2所示：片段為1-10nm，單體(Monomers)為5-15nm，低聚物為10-100nm，亞可見顆粒或不溶性微粒為10-100μm，可見顆粒或可見異物為大于等于50μm。
因此，對(duì)于物理檢查而言，如澄清度(濁度)、不溶性微粒、可見顆粒、顏色、溶解時(shí)間等檢定項(xiàng)目，是在可見或亞可見范圍內(nèi)．對(duì)抗體藥物的安全性進(jìn)行評(píng)價(jià)[4]。
圖2 粒徑分布圖
3.2 雜質(zhì)相關(guān)分析技術(shù)
3.2.1 基于毛細(xì)管電泳技術(shù)（CE）的純度和雜質(zhì)分析
《中國藥典》四部（2020版）通則0542表明，CE是一類以彈性石英毛細(xì)管為分離通道、以高壓直流電場為驅(qū)動(dòng)力，根據(jù)分子電荷和分子質(zhì)量大小不同實(shí)現(xiàn)分離的新型分離技術(shù)，是電泳與色譜結(jié)合的產(chǎn)物。在CE的多種分離模式中，依靠等電點(diǎn)分離的毛細(xì)管等電聚焦成像電泳、依靠電荷/質(zhì)量比分離的毛細(xì)管區(qū)帶電泳（CZE）和依靠相對(duì)分子質(zhì)量大小分離的毛細(xì)管凝膠電泳（CGE）是抗體類藥純度和雜質(zhì)分析中最常用的3種模式。
抗體類藥物分子的修飾，如糖基的唾液酸化、谷氨酸環(huán)化、二硫鍵的氧化等均會(huì)影響抗體的電荷異質(zhì)性及等電點(diǎn)。iCIEF中電解質(zhì)溶液形成pH梯度，各組分遷移至各自等電點(diǎn)時(shí)變?yōu)橹行孕纬蓷l帶，給出蛋白質(zhì)電荷異質(zhì)性分布的信息。CZE中各組分根據(jù)各自的電泳流和電滲流按陽離子（酸性峰）、中性粒子（主峰）和陰離子（堿性峰）的順序通過檢測器。目前，應(yīng)用于抗體類藥物還原和非還原性純度分析（大小異質(zhì)性）和N寡糖分析的CGE，由于樣品蛋白質(zhì)與十二烷基硫酸鈉（SDS）結(jié)合形成復(fù)合物，這種模式也被稱為SDS無膠篩分毛細(xì)管電泳（CE-SDS）。與SDS-PAGE比較，CE-SDS更快捷，耐用性更好，精密度及分辨率更高，且無拖尾峰、樣品殘留少、線性和重復(fù)性較高。由于CE-SDS檢測無需對(duì)結(jié)果進(jìn)行二次處理，其結(jié)果較SDS-PAGE 更準(zhǔn)確、穩(wěn)定、客觀，且CE-SDS法能將非糖基化重鏈與重鏈分離后對(duì)非糖基化重鏈進(jìn)行定量分析。
3.2.2 基于高效液相色譜技術(shù)（HPLC）的純度和雜質(zhì)分析
作為藥品檢測的常用技術(shù)，在眾多類型HPLC中，反相色譜（RP-HPLC）、分子排阻色譜（SEC-HPLC）和離子交換色譜（IEC-HPLC）已成為抗體類藥物不同方面質(zhì)量檢定的常用技術(shù)手段。
RP-HPLC 主要用于抗體類藥物的肽圖檢查，《中國藥典》四部（2020版）通則3405表明，通過胰蛋白酶裂解抗體類藥物，形成肽段，采用RP-HPLC分析鑒定其一級(jí)結(jié)構(gòu)的完整性和準(zhǔn)確性。肽圖是蛋白質(zhì)及其酶解產(chǎn)物的指紋圖譜，是抗體類藥物質(zhì)量控制和放行的必行檢測。該項(xiàng)檢測可監(jiān)控單個(gè)氨基酸的突變、氧化、去酰胺化，也能檢測抗體類藥物N-末端環(huán)化、C-末端賴氨酸處理、N-糖基化等一系列非預(yù)期的表達(dá)變異。
SEC-HPLC可通過分子篩原理將蛋白質(zhì)按多聚體、二聚體、單體及某些情況下出現(xiàn)的片段等小分子順序分離，依次通過檢測器。因此SEC-HPLC廣泛應(yīng)用于抗體類藥物聚合物的檢測，是目前常用的質(zhì)控及放行檢測方法。SEC-HPLC 可定量，二聚體和聚集體的分離度較高，分析時(shí)間較短，且操作簡單，可收集流分進(jìn)行進(jìn)一步分析。
IEC-HPLC是考察抗體類藥物電荷異質(zhì)性的另一種手段，與CE比較操作更簡單，且能檢測蛋白分子表面電荷分布差異的優(yōu)勢(shì)。弱陽離子交換色譜柱常用于測定抗體類藥物存在的酸性電荷異構(gòu)體（先于主峰出峰）與堿性電荷異構(gòu)體（晚于主峰出峰）。這些電荷異構(gòu)體多為主峰蛋白糖基化和去酰胺化的產(chǎn)物，但其有限的分辨率無法將各雜質(zhì)精確分離，該缺點(diǎn)也限制了其在抗體類藥物質(zhì)量控制領(lǐng)域更深入地應(yīng)用。
隨著質(zhì)譜技術(shù)的發(fā)展，液相色譜與質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)在抗體類藥物質(zhì)量控制領(lǐng)域發(fā)揮著越來越重要的作用。四極桿-飛行時(shí)間（Q-TOF）高分辨質(zhì)譜、基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜（MALDI-TOF-MS）及結(jié)合了高選擇性四極桿離子過濾與Orbitrap高分辨準(zhǔn)確質(zhì)量數(shù)技術(shù)的QE高分辨質(zhì)譜，在完整蛋白、肽圖分析、寡糖分析、蛋白定量、蛋白測序等抗體類藥物質(zhì)量控制領(lǐng)域具有明顯優(yōu)勢(shì)（圖3）。
圖3 Top-down MS
另外，親水作用液相色譜（HILIC-HPLC）配以熒光檢測器（FLD）或電噴霧檢測器（CAD）[5]也在抗體類藥物相關(guān)質(zhì)量控制方面發(fā)揮著重要作用，如寡糖鏈分析與工藝中引入的表面活性劑與藥用輔料檢測等。隨著多維液相色譜技術(shù)的發(fā)展，二維液相色譜（2D-HPLC）可將樣品中難分離、需富集的雜質(zhì)分離或富集用于與質(zhì)譜、紅外和核磁共振等的聯(lián)用分析中，在抗體類藥物雜質(zhì)分離與鑒定等分析中發(fā)揮著越來越重要的作用。
3.2.3 工藝相關(guān)雜質(zhì)分析
抗體類藥物除了進(jìn)行常規(guī)的無菌試驗(yàn)、異常毒性、熱源試驗(yàn)、內(nèi)毒素等安全性檢查外，其生產(chǎn)過程中HCP、DNA及純化過程使用的親和色譜蛋白A（Protein A）等工藝雜質(zhì)殘留量也需進(jìn)行嚴(yán)格控制。這些由生產(chǎn)過程引入的殘留雜質(zhì)不僅影響產(chǎn)品的效價(jià)，還可能在不同程度上引起機(jī)體的免疫應(yīng)答，最終引起過敏反應(yīng)或毒性、免疫原性、致癌性等嚴(yán)重的安全性問題。美國FDA規(guī)定，用一種靈敏度較高的方法檢測藥品的HCP，其含量應(yīng)低于檢測限（通常< 100 ppm）；《中國藥典》三部（2020版）規(guī)定，CHO細(xì)胞HCP占總蛋白含量的0.05%以下。雖然目前國際上針對(duì)HCP 的殘留限度尚無統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)，但ELISA法是與國際接軌的常用抗體類藥物HCP及Protein A殘留的檢測方法，也是目前《生物制品質(zhì)量控制分析方法驗(yàn)證技術(shù)審評(píng)一般原則》中推薦的檢測方法。WHO及國內(nèi)外藥物監(jiān)管機(jī)構(gòu)要求，CHO 宿主細(xì)胞DNA殘留量應(yīng)不高于10 pg。《美國藥典》（USP41-NF36版）指出，定量PCR法（q-PCR）的適用性較其他檢測方法更好。q-PCR 法對(duì)樣品的前期處理要求較高，但我國尚未建立統(tǒng)一的國家藥品質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)核酸信息平臺(tái)和DNA殘留量標(biāo)準(zhǔn)檢測方法，抗體類藥物中CHO宿主細(xì)胞殘留DNA的檢測均由各生產(chǎn)廠家自行檢測。
4. 展望
隨著抗體類藥物研究的深入及分析技術(shù)的發(fā)展，質(zhì)量源于設(shè)計(jì)（QbD）質(zhì)量控制理念的推廣，抗體類藥物雜質(zhì)分析正向自動(dòng)化、高特異性、高準(zhǔn)確度、高靈敏度、微型化及高通量實(shí)時(shí)快速檢測的方向發(fā)展，如芯片實(shí)驗(yàn)室（Lab-On-Chip）技術(shù)在雜質(zhì)殘留檢測領(lǐng)域不斷發(fā)展與探索[6]；自動(dòng)化處理平臺(tái)高通量蛋白純化、酶解、脫鹽、多肽分級(jí)、糖鏈富集等自動(dòng)化流程日趨成熟；高分辨質(zhì)譜（HRMS）定性定量技術(shù)在過程開發(fā)及批放行中的逐漸普及。
這些分析技術(shù)的發(fā)展正推動(dòng)著越來越多的新技術(shù)、新方法在抗體類藥物雜質(zhì)分析領(lǐng)域得到應(yīng)用。同時(shí)，隨著抗體類藥物的臨床應(yīng)用，出現(xiàn)了越來越多的不良反應(yīng)，對(duì)引起這些不良反應(yīng)的相關(guān)雜質(zhì)的深入研究將對(duì)抗體類藥物的有效性、安全性和一致性的提升起到推動(dòng)作用。
參考文獻(xiàn)
［1］BUSS N A,MCFARLANE M，et al. Monoclonal antibody therapeutics：history and future［J］. Curr Opin Pharmacol，2012，12（5）：615-622.
［2］郭莎，武剛等，抗PD-L1抗體的質(zhì)量控制研究。藥物分析雜志，2019，39（1）：21-30.
［3］Beck, A., et.al. Characterization of Therapeutic Antibodies and Related Products. Anal. Chem. 2013, 85, 715−736.
［4］王蘭，王軍志等，重組抗體藥物質(zhì)控中物理檢查的有關(guān)問題探討。藥物分析雜志，2015，35（11）：2036-2040.
［5］SCHILLING K，HOKZGRABE U. Recent applications of the charged aerosol detector for liquid
chromatography in drug quality control［J］. J Chromatogr A，2020，1619（1）：460911.
［6］HAJBA L，GUTTMAN A. Continuous-flow-based microfluidic systems for therapeutic monoclonal antibody production and organ-on-a-chip drug testing .J Flow Chem，2017，7（3-4）：118-123.
