前言
蛋白降解靶向嵌合體（即Proteolysis-Targeting Chimeras，在上下文中簡稱為“PROTAC”）是由靶向蛋白的配體（protein targeting moiety, PTM）與泛素連接酶配體（ubiquitin ligase moiety, ULM）連接而成的異雙功能分子（圖1）。它們的功能是誘導靶蛋白與泛素連接酶接近，導致泛素轉移并隨后引起泛素蛋白酶體系統對靶蛋白的降解。在過去的十年中，PROTAC作為新型治療藥物在學術界和制藥行業引發的關注呈現爆炸式增長。
圖1. PROTAC與靶蛋白之間誘導的三聚體復合物的結構-PROTAC-E3連接酶
與此同時，開發口服PROTAC藥物的最大障礙，是實現有效的口服吸收。就其性質而言，PROTAC不同于傳統的小分子藥物，不滿足經典的類藥五原則（Rule of Five），但卻在臨床研究中被證明有口服吸收的潛力。最近，人們對擴展五原則（eRo5）或者超越五原則（bRo5）的分子重新產生了興趣，Keith R. Hornberger和 Erika M. V. Araujo在Journal of Medicinal Chemistry雜志上發表了一篇文章，標題為Physicochemical Property Determinants of Oral Absorption for PROTAC Protein Degraders。在這篇文章中，他們利用ARVINAS公司現有的PROTAC數據庫，對影響PROTAC口服吸收的物理化學性質因素進行了全面的分析，討論了PROTAC在eRo5/bRo5空間中的位置，并針對口服PROTAC藥物的設計得出了幾個關鍵性結論。本文旨在對該文章進行詳細的解讀，希望為PROTAC藥物的研發提供思路。
引入評價吸收的關鍵指標摒利用度指標棄常用的口服生物
口服生物利用度（F）的定義為F = fa × fg × fh，其中fa為吸收分數，fg為胃腸道有效通過分數，fh為肝有效通過分數。口服吸收藥物經肝門靜脈進入肝臟，再經肝臟首過代謝后進入體循環， fh 可以定義為 1 -(Cl/Qh)，其中Cl為靜脈給藥的體內清除率，Qh為肝血流量。口服生物利用度Fobs可在實驗中通過對比口服和靜脈給藥后的血藥濃度時間曲線下面積（AUC）得到，但fa × fg從定義上更能代表藥物從腸道吸收的情況。雖然很難通過實驗直接測定fa或fg的值，但兩者的乘積可以估算，即fa × fg = Fobs /(1- (Cl/Qh ))。
許多先前將分子的物理化學性質與口服生物利用度Fobs聯系起來進行分析的方法是有一定缺陷的。為了說明這一點，Keith R. Hornberger和 Erika M. V. Araujo分析了表1中兩個化合物的情況。
表1. 口服生物利用度和腸道吸收情況存在潛在不一致
從表中可以看到，盡管兩個化合物的口服生物利用度均為5%，但是兩個化合物的腸道吸收能力差異較大。化合物A具有較高的肝臟清除率（90%肝血流量），而fa × fg為0.5，高肝臟清除是造成低口服生物利用度的主要因素。化合物B的肝臟清除率相對比較低（10%肝血流量），而fa × fg僅為0.06，低的腸道吸收是造成低口服生物利用度的主要因素。因此，fa × fg相比Fobs更適用于評估化合物的腸道吸收情況，它將肝臟清除率因素對生物利用度影響排除在外。
根據經驗設定fa × fg的閾值為0.25
通常認為一個比較令人滿意的吸收情況是化合物至少有20%的口服生物利用度和比較低的肝臟清除率（<25% Qh），計算得出的最小fa × fg約為0.26。因此，在后續的統計中，將fa × fg = 0.25設定為口服PROTAC分子一個閾值。
本次共有1806個PROTAC化合物參與了統計，選擇的種屬是大鼠，主要因為大鼠的靜脈和口服PK數據比較全面，同時大鼠也是臨床前毒理實驗常用的種屬。首先對這1806個化合物的fa × fg值進行了計算和統計，從圖2的結果中可以看到75%的化合物顯示了低或中等的體內清除，證明清除率不是影響口服吸收的主要因素。另外有233個化合物（約占13%）的清除率大于大鼠肝血流量，因此在后續的統計中剔除了這些清除率大于Qh（55 mL/min/kg）的分子，否則使用公式fa × fg = Fobs /(1- (Cl/Qh ))無法對數據進行有意義的評估。
圖2. 大鼠中Cl/Qh 值的分布(n=1806)
在對剩余的1573個化合物進行分析之前，首先對能同時得到大鼠和小鼠PK數據的1016個化合物進行了分析，利用小鼠的肝血流量90 mL/min/kg和大鼠的肝血流量55 mL/min/kg分別進行fa × fg計算，從圖3的結果中可以看到85%（861/1016）的PROTAC分子在大鼠中的fa × fg是低于在小鼠中的，即大多數PROTAC分子在大鼠體內的口服吸收比小鼠差，在藥物吸收方面大鼠對于藥物的篩選更為嚴格。
圖3. 大鼠和小鼠fa × fg數據的對比
接著研究人員對數據庫中PROTAC分子（n=1573）的理化性質與大鼠fa × fg值的關系進行了一個統計（圖4），結果概述如下：
氫鍵供體（HBD）有一個明顯的閾值，4個HBD達到fa × fg= 0.25 的上限。在經過對結構的分析后發現，幾乎所有（97%）HBD3或所有的HBD4都包含了1-2個分子內被結合的氫鍵供體。因此，HBD的閾值可以表述為未結合的HBD數量小于等于2個。也就是說當超過2個HBD時，可以引入分子內氫鍵受體與氫鍵供體結合，減小HBD的數量限制。
氫鍵受體（HBA）的上限為15。
可旋轉氫鍵（RB）的上限為14，拓撲分子極性表面積（TPSA）的上限為200 Å2。而之前認為要達到比較好的大鼠口服生物利用度，RB需要小于10，TPSA 要小于140 Å2。PROTAC的數據分析，擴展了原先的范疇。
在分子量（MW）、ClogP/D方面，得出的值也大大超出了原先的類藥五原則：MW上限為950；ClogP為1-7；ClogD為0-6。
芳香環數（NAr）的上限為5，上限為4更佳。因為僅有9%NAr為5的化合物得到較好的腸道吸收。
AB-MPS值（AbbVie multiparametric score）的計算方法為AB-MPS= ClogD + NAr + RB，AB-MPS被認為比單個的參數更適合預測低口服吸收的風險，分析得出AB-MPS的上限為20（圖5）。
圖4. PROTAC分子的理化性質與大鼠吸收的fa × fg值的關系
圖5. AB-MPS與大鼠吸收的fa × fg值的關系
表2總結了類藥五原則（Ro5），超越五原則（bRo5）以及口服PROTAC分子的理化性質上限，這對于后續的研究具有較大參考意義。從結果上看，與傳統的Ro5相比，口服PROTAC分子的HBA、RB、TPSA、MW和ClogP都有了明顯的擴展；而口服PROTAC分子的MW、HBA和ClogP與bRo5的上限比較接近。由于PROTAC分子的變色龍性質，對于ClogP和TPSA的限制并沒有那么大。相比之下，如果想要達到比較好的吸收，口服PROTAC分子對HBD的限制比較嚴格。
表2. Ro5 、bRo5和口服PROTAC分子的理化性質上限
應用口服PROTAC理化性質上限數據指導PROTAC分子設計
那么在實際研究中該如何應用這些數據呢？首先，研究人員計算了兩個代表性的泛素連接酶配體（ULM）的理化參數，即CRBN和VHL（圖6），并且計算了20個常用的連接子的平均理化參數，從而建立了一個適合口服吸收的PROTAC分子的靶向蛋白配體PTM的預算圖（圖7）。在去除了ULM（藍色部分）和連接子（橙色部分）之后，剩余的即是給PTM留下的空間（綠色部分）。
圖6. 兩個代表性的ULM的結構圖
圖7. 基于靶向(A) VHL或(B) CRBN作為E3連接酶配體的口服PROTACs的理化性質預算分析
基于以上分析，可以得到一些結論：
首先，只有明智地選擇相對緊湊的ULM，才能得到較好的口服吸收。在口服藥物設計過程中避免使用特別大的ULM，比如VHL配體。在數據分析中也可以發現，基于VHL的PROTAC無論是在大鼠還是小鼠中fa × fg都很難達到0.25以上。
其次，即使有一個比較合適的ULM，在PTM的選擇上仍然有比較大的限制，比如很難找到一個同時滿足含有未結合的氫鍵供體≤1個、氫鍵受體≤9個、TPSA≤120 Å2、可旋轉氫鍵數量≤10且分子量≤488的PTM先導化合物。
上述分析中，假定連接子部分經歷過優化并具備藥物的性質，若后續使用未經修飾的PEG-或烷基型連接子，PTM的可用范圍將會進一步縮小。
小結及展望
本文研究發現PROTAC在大鼠體內的口服吸收比小鼠差。而在小鼠之外的種屬中，PROTAC的藥代數據報道有限。目前也有一些文獻報道PROTAC分子在小鼠中有著比較好的口服吸收，包括基于VHL設計的分子。對待這些數據需要十分謹慎，為了支持最終的臨床開發，獲得跨物種的藥代動力學數據是重要的。
本研究采用了一個經驗性的閾值，即fa × fg=0.25，但是一個藥效足夠好的PROTAC，在fa × fg小于0.25時也可能具備了足夠的臨床暴露量來驅動療效。當然，這些化合物在臨床前和臨床開發中可能面臨著一些其他的挑戰，比如要求在臨床前毒理學研究中達到的暴露量數倍于有效暴露量。
在未來，如果需要更好地發揮PROTAC分子的潛力，在分子設計上也提出了幾個需求，比如需要更多的篩選工作來找到新的緊湊的ULM和PTM。PTM篩選庫中化合物的理化性質值得重新去思考并利用。采用PROTAC 體外ADME實驗更好預測體內藥代動力學性質，是一項持續的需求。當然也要更多地去關注PROTAC分子在非經腸給藥方面的潛力，雖然在早期臨床階段的開發中更傾向于口服給藥，但是在某些情況下，出于靶點、患者群體的需求等考量，靜脈注射或皮下給藥可能更加合適。未來，也期待更多口服PROTAC分子的成功。
參考文獻：
[1]Keith R. Hornberger and Erika M. V. Araujo, Journal of Medicinal Chemistry, 2023 66 (12), 8281-8287
