導語
抗體偶聯藥物(ADC)是一類新興的生物治療藥物，由抗體、連接子和小分子細胞毒素三部分組成。與傳統抗體藥物相比，結構會更加復雜，其復雜程度受抗體種類、偶聯方式、連接子與毒素種類等多個因素影響。因此ADC分析方法的建立具有特殊性，分析方法很難做到完全平臺化，需要根據每類ADC的自身質量屬性的特點進行差異化開發。隨著越來越多復雜形式ADC分子的出現，如何合理且準確地看到ADC特有的各類質量屬性將是未來的難點和挑戰。本文就ADC分析與表征的基礎技術做簡要介紹探討。
ADC產品關鍵質量屬性（Critical Quality Attributes, CQA）舉例如下圖所示。根據先驗知識和平臺經驗，與分子安全性和有效性相關的物理、化學、生物或微生物性質及特征，均可納入關鍵質量屬性，且需隨產品開發階段的進步而不斷加深研究。ADC主要的關鍵質量屬性包括一級結構、高級結構、純度與雜質、載藥量與藥物分布（Drug-to-Antibody Ratio, DAR）、含量、效價以及其他必須的生物制品質量屬性。
本文將從載藥量與藥物分布、游離藥物、分子大小變異體和電荷變異體四個方面進行介紹，討論各類分析技術是如何靈活配合用于表征分析ADC質量屬性。
DAR及其分布
DAR（Drug-to-Antibody Ratio），即藥物小分子與抗體分子的數量比例，可指示平均每個抗體上偶聯上的小分子藥物個數。DAR與ADC的療效和安全性直接相關，低載藥量（低DAR）會降低ADC的效力，而高載藥量（高DAR）會改變ADC分子的藥代動力學和毒性。常規用于定量DAR的方法有光譜（UV-Vis）、色譜（HPLC）和質譜（LCMS）等。如下圖所示，已上市ADC產品在DAR分析質控上主要是光譜和色譜這兩類技術。
（1）光譜方法（UV-vis）
可實現DAR監控需要有如下三個前提條件：
1）有效載荷應含有紫外可見發色團；
2）有效載荷和抗體在其紫外可見光譜中應顯示出不同的吸收峰屬性；
3）連接子-有效載荷的存在不影響ADC樣品中抗體部分的光吸收性質。
根據抗體部分和載荷部分的不同吸光度和消光系數，依據Beer-Lambert原理計算出DAR值及ADC濃度，典型圖譜及計算方式舉例如下
（2）色譜方法（HPLC）
常見的可用于DAR分析的色譜方法有疏水色譜（HIC）和反相色譜（RP）。疏水色譜利用不同載藥組分的疏水性質差異進行分離，不同的固定相（苯基、丁基、醚基等）具有不同的疏水性和選擇特性，采用高鹽濃度流動相使蛋白結合到固定相，繼而降低鹽濃度進行洗脫，這種溫和的結合與洗脫條件可以保持ADC藥物的天然構象。HIC是可在完整分子水平上監控DAR的最佳方法，可直接定量不載藥抗體（DAR0）組分，一般認為D0為非有效組分且會占據ADC結合位點影響ADC內吞。
反相色譜（RP）利用目標分子之間的極性差異進行分離，分離度較好，且方法本身質譜兼容，可直接進行不同載藥形式的分子量定性。反相方法也可直觀看到小分子藥物在不同位點的分布情況。如下圖所示，對于常規鏈間二硫鍵巰基偶聯的ADC分子，由于高載藥異質性，需對樣品進行還原后再進行分析，目標物非完整狀態，雖然可以監控藥物在不同位點的分布，但無法定量完整的不載藥抗體DAR0的比例。
（3）質譜方法（LC-MS）
質譜方法是另一種常用的DAR分析技術。目前使用電噴霧電離(ESI)與飛行時間(TOF)或具有更大質量范圍的Orbitrap可以以足夠的分辨率區分ADC的異質分子物種。例如，在還原和非還原條件下，通過完整的質量測量，可以獲得ADC分子的完整質量分布。
以上三種常規分析技術擁有各自的優點和最佳應用場景，可按照ADC分子特點和所處的開發階段，按需開發或配置相應的DAR定量方法。
游離藥物
所有ADC共有的一個重要質量屬性是游離(未結合)藥物的數量，這會引起對毒性和潛在安全問題的關注。未偶聯藥物或藥物相關雜質的殘留量可能殘留在最終產品中。未偶聯藥物的相關形式，如連接藥物種類或其他降解產物，也可以在偶聯物存儲期間釋放。因此，開發和應用合適的方法來檢測、表征和量化游離藥物是至關重要的。常規的游離藥物監控方法的開發思路如下。
分子大小變異體
分子大小變異體(聚集體、片段等)是重要的質量屬性，可直接影響蛋白質療法的療效或安全性。聚集是蛋白質最常見的物理降解途徑，且ADC比抗體更容易聚集，主要是因為藥物/連接子分子的存在，使連接位點的局部表面具有更多的疏水性。與抗體分析的技術一致，體積排阻色譜（SEC）、光散射（SEC-MALS）等常規技術可用于支持ADC分子聚合體的分析表征，非還原/還原毛細管電泳（non-reduced/reduced Capillary Electrophoresis）可用于支持ADC片段的分析表征。
電荷變異體
與抗體一致，ADC的電荷變異體是關鍵的質量屬性，因為它們對穩定性和生物活性有潛在影響。在ADC中可以觀察到各種形式的與電荷相關的異質性，貢獻這些異質性的因素包括抗體自身展示的電荷變異性、偶聯工藝過程引入的修飾、小分子藥物本身的結構以及在不同偶聯位點引起的電荷變化等。常規分析技術如離子交換色譜（Ion Exchange Chromatography，IEX）或者等點聚焦電泳（iCIEF）可以實現電荷變異體的監測。常規的電荷變異體表征策略也適用于ADC分子，富集單一變異體組分后，進行完整水平（Top-down）、亞基水平（Middle-down）或肽段水平（bottom-up）質譜解析。
ADC作為一種抗癌治療極具潛力的藥物，引起越來越多的興趣。與單獨的抗體相比，ADC由于偶聯的異質性而具有更高的結構復雜性。分析技術的改進提供了更好的工具去表征這些產品，從而為ADC開發人員提供工藝和處方開發所需的信息，并確定質量控制批放行和穩定性測試所需穩健耐用的方法。
參考文獻
1）Nakada, T., Sugihara, K., Jikoh, T., Abe, Y., & Agatsuma, T. (2019). The latest research and development into the antibody–drug conjugate, [fam-] trastuzumab deruxtecan (DS-8201a), for HER2 cancer therapy. Chemical and Pharmaceutical Bulletin, 67(3), 173-185.
2）Tong, J. T., Harris, P. W., Brimble, M. A., & Kavianinia, I. (2021). An insight into FDA approved antibody-drug conjugates for cancer therapy. Molecules, 26 (19), 5847.
3）Fu, Z., Li, S., Han, S., Shi, C., & Zhang, Y. (2022). Antibody drug conjugate: the “biological missile” for targeted cancer therapy. Signal Transduction and Targeted Therapy, 7(1), 93.
4）Kim, M. T., Chen, Y., Marhoul, J., & Jacobson, F. (2014). Statistical modeling of the drug load distribution on trastuzumab emtansine (Kadcyla), a lysine-linked antibody drug conjugate. Bioconjugate chemistry, 25(7), 1223-1232.
5）Wakankar A, Chen Y, Gokarn Y, et al. Analytical methods for physicochemical characterization of antibody drug conjugates[C]//MAbs. Taylor & Francis, 2011, 3(2): 161-172.
6）Matsuda Y, Mendelsohn BA. Recent Advances in Drug-Antibody Ratio Determination of Antibody-Drug Conjugates. Chem Pharm Bull (Tokyo). 2021;69(10):976-983.
7）Chapel, Soraya, et al. "Two-dimensional liquid chromatography coupled to high-resolution mass spectrometry for the analysis of ADCs." Antibody-Drug Conjugates: Methods and Protocols (2020): 163-185.
8）Hosken D., Li C., Mullappally B., Co C., Zhang B.. Isolation and Characterization of Monoclonal Antibody Charge Variants by Free Flow Isoelectric Focusing Brian. Anal Chem 2016, 88, 5562-5569
9）Deslignière, Evolène, et al. "A Combination of Native LC-MS Approaches for the Comprehensive Characterization of the Antibody-Drug Conjugate Trastuzumab Deruxtecan." Frontiers in Bioscience-Landmark 27.10 (2022): 290.
