摘要
抗體偶聯(lián)藥物（antibody drug conjugate，ADC）通常由抗體通過鏈接體與毒素小分子偶聯(lián)而成，同時具備抗體的高靶向性和小分子藥物的高活性，使之作為一種新興的靶向治療手段，在腫瘤治療領(lǐng)域展現(xiàn)出了優(yōu)秀的療效和潛力，成為藥物研發(fā)領(lǐng)域的新熱點。目前全球已有14款A(yù)DC藥物獲批上市，處于臨床研究階段的ADC候選藥物分子超過140個。為了進一步提高ADC藥物的安全性和有效性，近年來涌現(xiàn)出了各種新穎的技術(shù)。本文對ADC藥物分子的關(guān)鍵元素，包括抗體、鏈接體、毒素小分子以及偶聯(lián)技術(shù)等方面的最新研究進展進行總結(jié)，并討論其優(yōu)缺點。期望這些討論能夠幫助增加對ADC藥物研究和開發(fā)更加系統(tǒng)的理解，為研發(fā)出更加高效和安全的ADC藥物帶來一些思考。
正文
抗體偶聯(lián)藥物（antibody drug conjugate，ADC）作為一類新興的大分子靶向藥物，目前主要用于治療各種腫瘤。ADC藥物由靶向腫瘤細胞過度表達的表面受體的抗體、高活性的細胞毒素小分子和鏈接體3個部分組成。其中，抗體部分負責將ADC藥物分子精準運送至靶細胞表面，鏈接體負責在靶細胞內(nèi)或表面釋放毒素小分子，而高活性的細胞毒素小分子則高效地殺傷腫瘤細胞，因此ADC也被通俗地稱為“生物導彈”或者“魔法子彈”。
魔法子彈這一概念是由諾貝爾獎獲得者德國科學家Paul Ehrlich在20世紀初提出的，特指一類能靶向結(jié)合目標病灶進而治愈疾病的一類分子。而將這一概念實物化為抗體加上毒素小分子這一藥物分子形式的時間則是在1957年，Mathé等將化療藥物甲氨蝶呤通過重氮偶合反應(yīng)偶聯(lián)至抗L1210白血病細胞的免疫球蛋白上，該偶聯(lián)物展現(xiàn)了針對靶細胞L1210的細胞增殖抑制作用，而偶聯(lián)至常規(guī)β球蛋白的偶聯(lián)物則無作用。又經(jīng)過十多年的發(fā)展，在1970年代中期，有多個利用動物源免疫球蛋白制備的ADC在臨床試驗中展現(xiàn)出了確定的療效。到1980年代，單克隆抗體開發(fā)技術(shù)和重組蛋白生產(chǎn)技術(shù)的進步、多種腫瘤標志物的確證，以及對靶點抗原-抗體介導的細胞內(nèi)吞機制的闡明，同時在靶點、抗體以及鏈接體等多個方面給ADC藥物的技術(shù)發(fā)展帶來了巨大推動力，進而在1990年代吸引了藥物研發(fā)和生物科技公司加大投入ADC藥物的開發(fā)，并于2000年迎來第一個ADC藥物Mylotarg®的獲批上市。Mylotarg®是CD33靶向的ADC用于治療急性髓系白血病（acute myeloid leukemia，AML）。又過去了十多年后，用于治療霍奇金淋巴瘤（Hodgkin lymphoma，HL）和間變性大細胞淋巴瘤（anaplastic large cell lymphoma，ALCL）的CD30靶向的Adcetris®在2011年獲批上市，用于治療晚期轉(zhuǎn)移性乳腺癌的HER2靶向的Kadcyla®于2013年獲批上市。這兩款A(yù)DC藥物在晚期腫瘤患者中的顯著療效和良好的安全性，使得ADC藥物正式作為一類新型的治療手段得到腫瘤患者、腫瘤醫(yī)療界和生物制藥工業(yè)界的廣泛認可，迅速成為了全球生物醫(yī)藥學術(shù)界以及工業(yè)界的熱點領(lǐng)域之一，更值得一提的是日本第一三共公司開發(fā)的HER2靶向的ADC藥物Enhertu®在2019年首次獲批上市，其具有劃時代的意義，不僅針對HER2高表達的腫瘤有顯著療效，而且在HER2低表達晚期乳腺癌患者中也表現(xiàn)了明顯療效。截至2023年3月全球已有14款A(yù)DC藥物獲批上市（表1），其中9款是在近4年內(nèi)獲批的，2022年ADC藥物全球銷售額達到67.8億美元，處于臨床研究階段的ADC藥物分子則超過140個，而且呈現(xiàn)逐年快速增長的趨勢有望給腫瘤患者帶來更有效的治療藥物。
這些ADC藥物的成功獲批上市，一方面證明了此類新型藥物對于腫瘤治療的顯著療效和潛力，另一方面這些藥物在臨床試驗和獲批上市后大量病人使用過程中也逐步揭示了現(xiàn)有ADC藥物的局限性，例如脫靶毒性、復(fù)雜的藥代動力學特性、靶標組織富集度不足、耐藥性、實體瘤穿透力不夠等。為了進一步提高ADC藥物的療效，降低其毒副作用，各種新穎的技術(shù)和解決方案層出不窮。本文將從ADC的關(guān)鍵組分，包括抗體、鏈接體、毒素小分子以及偶聯(lián)技術(shù)等方面概述其新近的研究進展，討論目前ADC藥物開發(fā)所面臨的挑戰(zhàn)和發(fā)展機遇。
經(jīng)典的ADC藥物由單克隆抗體、鏈接體和毒素小分子3部分組成（圖1a）。每個組成部分發(fā)揮著不同的功能：抗體部分負責將ADC分子選擇性地遞送至腫瘤細胞表面，同時通過靶點介導的內(nèi)吞作用進入到細胞內(nèi)；鏈接體則負責在腫瘤細胞內(nèi)或者表面高效釋放毒素小分子，而在血液循環(huán)系統(tǒng)中保持穩(wěn)定；毒素小分子則負責高效地殺傷腫瘤細胞，有些小分子還同時具備細胞穿膜滲透性，可以通過擴散效應(yīng)作用于靶細胞周圍的腫瘤細胞，起到“旁殺效應(yīng)（bystander effect）”（圖1b）。因此，ADC藥物每個組成部分的特性都對其發(fā)揮靶向治療作用至關(guān)重要，同時各個組分的選擇也都可能會影響到ADC的安全性和有效性。
1、抗體
作為ADC藥物的主體框架結(jié)構(gòu)和導航系統(tǒng)，理想的抗體組分需具備較低的免疫原性、特異性的靶點結(jié)合和高親和力、較長的半衰期、良好的血液循環(huán)系統(tǒng)穩(wěn)定性以及能介導高效的內(nèi)吞效應(yīng)等特性。抗體是ADC分子的主要組成部分，占其分子質(zhì)量的80%以上，ADC的潛在免疫原性主要來源于抗體。早期的ADC藥物，由于采用鼠源的抗體，通常會在病人體內(nèi)引發(fā)較強的免疫反應(yīng)，產(chǎn)生抗藥抗體，進而導致療效降低和其他副反應(yīng)。后來，為了克服免疫原性這一缺點，在單克隆抗體發(fā)現(xiàn)技術(shù)和基因工程技術(shù)進步的加持下，改進和優(yōu)化出了人鼠嵌合抗體。人鼠嵌合抗體是由鼠源的抗原結(jié)合區(qū)（Fab）與人源的恒定區(qū)（Fc）嵌合而成，此種組合大大降低了其免疫原性，采用嵌合抗體的ADC也在臨床上展現(xiàn)了良好的療效和耐受性。第二款獲批上市的靶向CD30的ADC藥物Adcetris®就是采用人鼠嵌合的抗體，在治療 霍奇金淋巴瘤（Hodgkin lymphoma）和ALCL上展現(xiàn)了顯著的療效。然而，也有研究顯示在使用嵌合抗體治療的病人體內(nèi)，所產(chǎn)生的抗藥抗體中的絕大部分是針對其鼠源的Fab區(qū)域，這也會影響其療效。因此，為了進一步控制和降低免疫原性的風險，人源化抗體應(yīng)運而生，它僅保留鼠源的抗原抗體結(jié)合域（complementarity determining region，CDR），F(xiàn)c片段及其他框架結(jié)構(gòu)則采用人源的，這樣也進一步降低了抗體的免疫原性，目前已獲得批準上市的14款A(yù)DC藥物中，有12款采用人源化抗體。最近的一些研究則更進一步，采用全人源抗體替代人源化的抗體開發(fā)ADC藥物，以期會更進一步降低其免疫原性的風險，目前這一類ADC還處于研究階段。
除免疫原性外，抗體的高選擇性和特異性也對ADC藥物的安全性和有效性至關(guān)重要，它使得ADC藥物能通過結(jié)合靶標而富集在腫瘤組織中，而與正常組織不結(jié)合或者較低結(jié)合。抗體的選擇性與特異性，與靶點的組織分布息息相關(guān)。第一，為了降低靶點相關(guān)的毒副作用，ADC藥物的理想靶點最好是僅在腫瘤細胞表達，而在正常細胞中不表達或者低表達；第二，理想的ADC靶標應(yīng)為細胞表面抗原，而不是胞內(nèi)抗原，使之能被循環(huán)系統(tǒng)中的ADC藥物接觸、識別并結(jié)合；第三，此靶點抗原最好不是分泌型抗原，因為分泌至循環(huán)系統(tǒng)中的抗原會與ADC藥物結(jié)合后消耗藥物而導致其可能無法以高濃度富集于腫瘤組織，影響其安全性和有效性；第四，腫瘤靶點在結(jié)合抗體或者ADC后能高效地介導內(nèi)吞作用，目前主流的ADC藥物發(fā)揮作用時均需要內(nèi)吞至細胞內(nèi)并轉(zhuǎn)運至溶酶體中釋放毒素小分子，才能發(fā)揮腫瘤細胞殺傷作用，如人表皮生長因子受體2（human epidermal growth factor receptor 2，HER2）就是一個理想的靶點，其在某些腫瘤細胞上的表達約為正常組織的100倍，同時它是細胞表面非分泌型受體，能高效地介導ADC藥物諸如Kadcyla®、Enhertu®以及愛地希®等HER2靶向ADC藥物的內(nèi)吞。
ADC藥物的藥效與抗體-靶點抗原的親和力密切相關(guān)，目前大部分的ADC與靶點的親和力在0.1~1.0 nmol/L的范圍內(nèi)，而目前業(yè)界對于抗體最優(yōu)的親和力并沒有定論。一種假設(shè)認為過高的親和力會導致產(chǎn)生“結(jié)合位點屏障”，是指在應(yīng)用ADC治療實體瘤時，對靶點結(jié)合的高親和力會導致ADC被限制在腫瘤組織表面而無法穿透到腫瘤組織內(nèi)部，從而降低其治療效果。而最近Tsumura和同事對同靶點而親和力不同的3種ADC分子的藥效和穿透效果進行了研究，結(jié)果顯示高親和力的ADC會穿透且分布在整個腫瘤組織，而低親和力的ADC反而只能富集在腫瘤組織表面接近血管的部位，而且這種作用在體積大的腫瘤里才能表現(xiàn)出來。因此，在設(shè)計ADC藥物時，選擇靶點親和力適當?shù)目贵w對于其內(nèi)吞和藥效非常關(guān)鍵。另外，在選擇ADC藥物的抗體時，針對同一靶點不同表位的抗體，其內(nèi)吞效果也不盡相同。
近些年，除了利用單克隆抗體作為載具的ADC外，也有很多研究嘗試使用其他形式的抗體，例如雙抗、抗體片段或納米抗體等來開發(fā)ADC，以期進一步提高ADC藥物的安全性和有效性。
雙抗是一種在單抗的基礎(chǔ)上設(shè)計出的能同時識別和結(jié)合兩種不同抗原或同一抗原兩個不同表位的一類抗體分子。這些分子有些與傳統(tǒng)的IgG類似，由兩個Fab片段與Fc片段通過鉸鏈區(qū)結(jié)合在一起，兩個Fab片段分別識別不同的抗原或表位。另一些分子則設(shè)計得更加復(fù)雜，通過各種手段在IgG的特定位置附加上第二個抗原結(jié)合域。目前被應(yīng)用于ADC藥物開發(fā)的主要是與傳統(tǒng)IgG分子結(jié)構(gòu)相似的這一類雙抗。目前的研究數(shù)據(jù)表明，有的雙抗ADC能提高腫瘤細胞靶向性，增強靶點介導的內(nèi)吞作用，從而提高藥效，降低對正常組織的毒性。如Sellman等運用靶向EGFR和cMET的雙抗開發(fā)出一種ADC，相比與EGFR單抗ADC或者cMET單抗ADC在同時表達兩種抗原的腫瘤細胞上有更好的選擇性，而且他們認為通過進一步地調(diào)整雙抗兩個結(jié)合臂與EGFR和cMET靶點的親和力，能設(shè)計出靶點選擇性更高的ADC，從而拓寬其治療窗。Andreev和同事則設(shè)計了一種靶向HER2和PRLR（prolactin receptor）的雙抗ADC，與針對這兩個靶點的單抗ADC相比，它具備更好的乳腺癌細胞殺傷效果。同時，他們的研究還闡明了其中的作用原理：雙抗ADC由于雙靶點結(jié)合介導的內(nèi)吞作用更快更強，因此能遞送更多的ADC分子進入胞內(nèi)，釋放更多的毒素小分子從而更有效地殺傷腫瘤細胞。
ADC藥物目前面臨的挑戰(zhàn)之一是分子質(zhì)量過大，難于穿越各種生物屏障到達并穿透實體瘤腫瘤組織，影響其治療實體瘤的效果。為了提高ADC藥物治療實體瘤的效果，研究者們希望通過縮小抗體框架結(jié)構(gòu)來降低ADC的總體分子大小，增強其腫瘤穿透力。作為ADC藥物的框架結(jié)構(gòu)，這些縮小版的抗體首先必須保留其抗原抗體結(jié)合能力，如天然抗體的組件F（ab）2、F（ab）2'、Fab和Fv片段等（圖2）。另外，通過抗體工程改造獲得的scFv以及Diabody等則有更好的穩(wěn)定性和靶向效率。還有一類縮小版抗體則是人源化的非典型抗體片段，如來源于駱駝和羊駝的VHH片段，以及來源于鯊魚的VNAR片段等，這一類通常被稱為納米抗體。這3種縮小版的抗體都已被用于探索開發(fā)縮小版ADC。在天然抗體片段中，利用Fab來設(shè)計ADC分子的研究較多。Fab片段包括抗體的單側(cè)抗原結(jié)合臂，由抗體的輕鏈和重鏈可變區(qū)加CH1區(qū)段組成，分子質(zhì)量約為50 ku，可通過酶解完整抗體或者重組表達獲得［5。早期的 Fab-ADC采用中等活性的化療藥物紫杉醇和阿霉素作為毒素小分子，其腫瘤抑制活性達不到常規(guī)ADC的水平。直到Badescu及其同事利用赫賽汀的Fab片段與MMAE偶聯(lián)得到的ADC，在體外細胞實驗中展示出了亞納摩爾級別的活性，與常規(guī)ADC相當。但是在體內(nèi)動物實驗中，該ADC在劑量高達20 mg/kg時才展現(xiàn)出了中等程度的腫瘤抑制作用，與常規(guī)ADC的1~10 mg/kg的有效腫瘤控制劑量相差甚遠，分析原因可能是因為缺少Fc-FcRn循環(huán)和較高的泌尿系統(tǒng)清除率導致整體腫瘤暴露量低于常規(guī)ADC，所以整體抗腫瘤活性達不到常規(guī)ADC的水平。其他一些以Fab為基礎(chǔ)的ADC分子，有的在體外活性方面就低于常規(guī)ADC，有些則是與Badescu研究組的結(jié)果一樣，在體內(nèi)活性方面不如常規(guī)ADC，因此目前工業(yè)界很少有此類ADC進入臨床研究。以scFv及其衍生體作為載體則是縮小版ADC的另一個研究方向，scFv由抗體的輕鏈和重鏈的可變區(qū)通過一段短肽或者二硫鍵鏈接而成，其分子質(zhì)量約為30 ku，且容易在原核細胞中表達，scFv類的ADC已在多個臨床前研究中顯示出良好的可開發(fā)潛力，在采用特殊的重輕鏈連接方式后，可以通過表面賴氨酸偶聯(lián)高達10個毒素小分子，在偶聯(lián)奧瑞他汀（Auristatin）和美登素（Maytansine）后展現(xiàn)出與常規(guī)ADC類似的體外腫瘤細胞殺傷活性，同時其腫瘤穿透力也遠高于常規(guī)ADC。英國的生物技術(shù)公司Antikor的研究顯示，他們的scFv-ADC比常規(guī)ADC有更好的耐受性和安全性，且比Fab等其他抗體片段ADC，其系統(tǒng)清除慢很多，與采用白蛋白輔助延長半衰期手段的抗體片段類似，目前Antikor公司的scFv ADC產(chǎn)品正在臨床前開發(fā)中。全球ADC研發(fā)先驅(qū)者Seagen公司曾經(jīng)采用抗CD30的Diabody制備ADC并與常規(guī)ADC進行頭對頭對比研究，結(jié)果顯示雖然其藥效僅為常規(guī)ADC的1/3，但是這是在其血液暴露量僅為常規(guī)ADC 1/30的情況下產(chǎn)生的。因此，如果通過諸如聚乙二醇化等方法降低其系統(tǒng)清除率，Diabody ADC有可能會比常規(guī)ADC有更好的效果。此外，另一種具備抗原結(jié)合能力的抗體Fc片段（Fcab）介導的ADC也展現(xiàn)出了與常規(guī)ADC相當?shù)捏w外腫瘤細胞殺傷活性，同時由于其分子質(zhì)量僅為抗體的1/3，使得它具備更好的腫瘤穿透力，同時它還具備完整的Fc功能，使得它的半衰期較一般抗體片段長（小鼠血液半衰期為60~85 h），因此具備一定的開發(fā)潛力。另外，采用納米抗體的ADC也展現(xiàn)出了良好的體外和體內(nèi)腫瘤殺傷作用，如Crescendo Biologics公司的CB108，就是一種采用人的重鏈可變區(qū)的靶向PSMA（prostate-specific membrane antigen）的納米抗體ADC，展現(xiàn)出了良好的體內(nèi)療效和腫瘤穿透性；同時它還包含有抗白蛋白的結(jié)合域，通過與血清白蛋白的結(jié)合來延長其半衰期，同時還保留其高腫瘤穿透性。另一家公司Elasmogen也正采用類似的納米抗體在開發(fā)ADC，其納米抗體來源于鯊魚的抗體可變區(qū)。
圖2 用于ADC藥物的抗體片段和納米抗體結(jié)構(gòu)示意圖
Fig. 2 Structure illustration of IgG fragments and nanobodies utilized in ADCs
2、鏈接體
鏈接體負責將ADC的抗體和細胞毒小分子鏈接在一起，對于ADC藥物的安全性和穩(wěn)定性至關(guān)重要。理想的鏈接體需要在血液循環(huán)中足夠穩(wěn)定，能有效避免ADC藥物在血液循環(huán)中和正常組織中釋放毒素小分子并使之保持穩(wěn)定且非活性狀態(tài)，而同時又需要能在腫瘤組織和細胞內(nèi)高效釋放毒素小分子。另外由于毒素分子通常為疏水性強的化學小分子，鏈接體需要具有良好的親水性來連接毒素分子以便于后續(xù)在水相中與抗體進行偶聯(lián)反應(yīng)并避免大量蛋白聚集體的產(chǎn)生而導致ADC的產(chǎn)率下降。目前常見的ADC鏈接體有兩類：不可剪切鏈接體和可剪切鏈接體，它們各有各的特點。近幾年，這兩類鏈接體通過不斷的改進和優(yōu)化，開發(fā)出了各種能顯著提高ADC穩(wěn)定性和親水性的鏈接體。
鏈接體一般包括4個分子片段：抗體連接片段、調(diào)節(jié)片段、酶降解片段和自裂解片段（表2）。開發(fā)者通常依據(jù)毒素小分子的特性以及與抗體連接的方式，并結(jié)合對ADC分子的影響，開展綜合分析評估來篩選上述4個片段，最終確定鏈接體的結(jié)構(gòu)。
鏈接體的穩(wěn)定性決定了ADC藥物中的毒素小分子是傳遞到腫瘤細胞內(nèi)部還是有可能在運輸過程中過早釋放并跟隨血漿傳遞到所有組織，顯著影響ADC藥物的安全性和有效性。ADC藥物的穩(wěn)定性一般受抗體與鏈接體的偶聯(lián)方式、調(diào)節(jié)片段和氨基酸片段3個方面的影響，其中，偶聯(lián)方式由抗體連接片段決定，常見連接片段的特點及結(jié)構(gòu)舉例見表3。
除連接片段外，調(diào)節(jié)片段和氨基酸片段的結(jié)構(gòu)也對鏈接體穩(wěn)定性有影響，特別是構(gòu)建氨基酸片段的氨基酸種類和序列，對鏈接體的穩(wěn)定性甚至有決定性的作用。2021年，李卓榮課題組報道了不同鏈接體與MMAE構(gòu)建的鏈接體-藥物，發(fā)現(xiàn)在氨基酸片段為纈氨酸-瓜氨酸（VC）時，調(diào)節(jié)片段為環(huán)己基組成的鏈接體比起正己基或苯基組成的鏈接體更穩(wěn)定，而在調(diào)節(jié)片段為環(huán)己基時，氨基酸片段為甘氨酸-苯丙氨酸-亮氨酸-甘氨酸（GFLG）組成的鏈接體穩(wěn)定性要遠低于其他氨基酸片段組成的鏈接體。
在調(diào)節(jié)片段中引入磺酸或聚乙二醇等極性基團，既能夠增強鏈接體-藥物的水溶性，降低制備ADC分子時產(chǎn)生聚集體的幾率，又能夠增強毒素小分子克服P糖蛋白（P-glycoprotein，Pgp）外排效應(yīng)的能力。Kovtun等研究了分別包括環(huán)己基和四聚乙二醇兩個調(diào)節(jié)片段的鏈接體在ADC中的應(yīng)用，發(fā)現(xiàn)使用四聚乙二醇片段的ADC在具有多藥耐藥性（multi-drug resistance）細胞系COLO 205MDR CDX模型中具有更好的細胞殺傷效應(yīng)，即使給藥劑量降低1倍，也能夠有效地抑制腫瘤細胞生長。
總體而言，鏈接體的設(shè)計對于ADC來說至關(guān)重要。近些年鏈接體技術(shù)方面也有一些新的擴展，例如Bolt公司的BDC-1001和Silverback公司的SBT6050及SBT6290等多款免疫激動劑抗體偶聯(lián)物（ISAC）所采用的在腫瘤微環(huán)境釋放的一類鏈接體，該類ADC分子通過抗體與腫瘤細胞表面非內(nèi)吞靶標或腫瘤微環(huán)境中的特異性靶點結(jié)合，然后在腫瘤細胞外釋放毒素小分子，利用毒素小分子的旁殺效應(yīng)或激活腫瘤組織浸潤的免疫細胞，達到抑制腫瘤細胞增殖的作用。
與常規(guī)ADC相比，非內(nèi)吞ADC對鏈接體的要求有著顯著的區(qū)別（表4），需要能夠在腫瘤微環(huán)境中通過不同的方式有效釋放載荷分子，而不是在細胞內(nèi)的溶酶體中。
3、毒素小分子
毒素小分子是ADC藥物中主要負責執(zhí)行細胞殺傷功能的組件，它需要具備較高的活性使之能在較低的劑量下有效殺傷腫瘤細胞。目前主流的ADC藥物其毒素小分子的細胞抑制的IC50基本在10-9~10-12 mol/L范圍之間。同時，它還需要具備很好的穩(wěn)定性，使之在循環(huán)系統(tǒng)和溶酶體中保持結(jié)構(gòu)完整和活性。另外，它還需要分子質(zhì)量足夠小，免疫原性低，也需具備方便與鏈接體進行化學反應(yīng)的位點。目前常見的毒素小分子主要包括微管蛋白抑制劑和DNA復(fù)制的抑制劑，隨著日本第一三共公司的重磅ADC藥物Enhertu®應(yīng)用拓撲異構(gòu)酶抑制劑的成功，越來越多的細胞毒性相對較低的小分子進入到ADC藥物開發(fā)者的工具箱，如針對拓撲異構(gòu)酶的喜樹堿類、RNA聚合酶抑制劑、細胞凋亡調(diào)控藥物等，常見毒素小分子匯總于表5。
3.1 微管蛋白抑制劑
微管蛋白作為細胞骨架的主要構(gòu)成物質(zhì)，除能夠支撐細胞結(jié)構(gòu)完整性外，同時還在細胞增殖的有絲分裂階段具有至關(guān)重要的作用。通過抑制微管蛋白的生成和聚集（polymerization），既能夠殺傷腫瘤細胞，也可以抑制腫瘤細胞的快速增殖。常用于ADC構(gòu)建的微管蛋白抑制劑包括美登素（Maytansines）、海兔毒素（Auristatins）和Tubulysins等。
現(xiàn)階段，已進入商業(yè)化的14款A(yù)DC藥物中，有8款所使用的毒素小分子是該類化合物，其中5款使用MMAE（海兔毒素衍生物）、1款使用MMAF（海兔毒素衍生物）、1款使用DM1（美登素衍生物）和1款使用DM4（美登素衍生物）。微管蛋白抑制劑類化合物的特點是：殺傷細胞活性高，IC50一般在10-9~10-10 mol/L之間；具有一定的親水性，不易引起大分子聚集；起效速度快，短時間內(nèi)即可殺傷腫瘤細胞。雖然MMAE應(yīng)用廣泛，但因其是Pgp底物而存在多藥耐藥性的問題。
而Tubulysins類化合物作為微管蛋白抑制劑則不是Pgp底物。該類化合物的結(jié)構(gòu)均具有官能團——羧基，這一親水性基團增加了毒素小分子的極性進而規(guī)避了Pgp的外排效應(yīng)，毒素在隨著ADC分子進入腫瘤細胞后起到殺傷效力，但同時，由于細胞膜穿透能力的降低，無法擴散至周圍腫瘤組織，因此也就不具備旁殺效應(yīng)。
3.2 DNA損傷劑
DNA損傷劑因作用機制不同而分為3大類：DNA雙鏈破壞劑、DNA插入劑和DNA烷基化劑。DNA在細胞的生長和增殖過程中至為關(guān)鍵，對其進行破壞，能夠高效殺傷腫瘤細胞并抑制其快速增殖。值得注意的是，部分DNA損傷劑，如PBD dimer和Duocarmycins，在動物中高劑量給藥時，可能產(chǎn)生延遲毒性，因此在給藥周期設(shè)計時，應(yīng)謹慎考慮。
3.2.1 DNA雙鏈破壞劑
DNA雙鏈破壞劑的化學結(jié)構(gòu)中包含一段烯二炔片段，進入細胞核后，該片段發(fā)生Bergman環(huán)化反應(yīng)，形成苯環(huán)雙自由基過渡態(tài)，誘導DNA雙鍵斷裂。此類毒素小分子的代表是卡利霉素衍生物γ1（calicheamicin gamma 1），輝瑞公司的2款商業(yè)化ADC藥物Mylotarg®和Besponsa®均使用該類化合物。
3.2.2 DNA插入劑
在DNA復(fù)制和轉(zhuǎn)錄階段，拓撲異構(gòu)酶I發(fā)揮著重要的作用，它以共價鍵的形式與DNA形成一個可裂解的復(fù)合物，從而產(chǎn)生一個單鏈缺口，另一條未受損的單鏈從缺口中回轉(zhuǎn)，使超螺旋的DNA松弛，以利于復(fù)制和轉(zhuǎn)錄，當解旋完成后拓撲異構(gòu) 酶I脫離并促使DNA鏈復(fù)原。因此，如果能在拓撲異構(gòu)酶I與DNA形成可裂解復(fù)合物的階段引入一個分子，能夠阻擋未受損單鏈的回轉(zhuǎn)，就可以阻止DNA的復(fù)制和轉(zhuǎn)錄，誘導腫瘤細胞死亡。喜樹堿就是這樣一類拓撲異構(gòu)酶I抑制劑類化合物，目前已有2款商業(yè)化ADC藥物Enhertu®和Trodelvy®使用該類化合物作為毒素小分子。喜樹堿類化合物的細胞殺傷活性相較于微管蛋白抑制劑弱1~2個數(shù)量級，能夠擴展ADC藥物的治療窗，提高給藥劑量。
3.2.3 DNA烷基化劑
DNA烷基化劑一般能夠與DNA小溝結(jié)合，之后，利用分子內(nèi)易與氨基反應(yīng)的官能團，如碳氮雙鍵或環(huán)丙烷結(jié)構(gòu)，與鳥嘌呤或腺嘌呤發(fā)生親核反應(yīng)，在DNA中形成鏈間或鏈內(nèi)交聯(lián)，阻止其復(fù)制和轉(zhuǎn)錄，導致腫瘤細胞死亡。
該類化合物細胞殺傷活性在皮摩爾級別，比微管蛋白抑制劑活性更強，因此，能夠大幅降低ADC的給藥劑量，但治療窗也會相應(yīng)縮小。常用的DNA烷基化試劑為PBD（pyrrolobenzodiazepine）二聚體和Duocarmycin兩類化合物，目前已進入商業(yè)化的ADC中僅有一款使用PBD二聚體作為毒素小分子——CD19靶向的Zynlonta®。
3.3 其他毒素小分子
除上述主要已應(yīng)用于商業(yè)化ADC藥物的毒素小分子外，其他各類作用機制的毒素也被逐步應(yīng)用于ADC藥物開發(fā)中，如Bcl-xL抑制劑、RNA剪切酶抑制劑、RNA聚合酶抑制劑等。另一類新穎毒素小分子則作用于細胞膜表面靶標或者腫瘤組織基質(zhì)靶標，用于非內(nèi)吞型ADC藥物的開發(fā)，如NKA（Na+/K+-ATPase，鈉鉀離子泵ATP酶）抑制劑、基質(zhì)金屬依賴性蛋白酶（matrix metalloproteinases，MMP）抑制劑和免疫激動劑等，其各自的作用機制如表6所示。
4、偶聯(lián)技術(shù)
ADC藥物開發(fā)成功的另一個重要元素是將小分子組分（鏈接體或鏈接體-毒素小分子）加載在抗體分子上的方式和技術(shù)。偶聯(lián)反應(yīng)策略和過程，決定了載藥量（drug antibody ratio，DAR）和載藥分布方式等關(guān)鍵質(zhì)量屬性，與ADC藥物的有效性和安全性直接相關(guān)。理想的ADC偶聯(lián)策略或技術(shù)需具備如下特點：a. 抗體與小分子結(jié)合部分的化學鍵或基團應(yīng)足夠穩(wěn)定，確保其在循環(huán)系統(tǒng)中的穩(wěn)定性；b. 偶聯(lián)位點不會干擾抗體的功能，特別是與靶點抗原結(jié)合的特異性和高親和力；c. 偶聯(lián)過程涉及的反應(yīng)必須有足夠高的選擇性和反應(yīng)效率，同時應(yīng)易于控制載藥量和載藥分布。
目前的ADC偶聯(lián)技術(shù)大致可以分為兩種類別，一種是利用抗體序列中天然的具備反應(yīng)活性的氨基酸殘基（如表面賴氨酸的側(cè)鏈氨基和鏈間二硫鍵還原后的巰基）來介導的偶聯(lián)技術(shù)，目前已上市的13款A(yù)DC藥物采用此類偶聯(lián)技術(shù)；另一類技術(shù)，則是通過化學修飾、基因工程技術(shù)或者酶修飾等手段在抗體特定位點引入可供反應(yīng)的基團，再偶聯(lián)上毒素小分子，實現(xiàn)特定位點偶聯(lián)。此類技術(shù)主要包括工程化半胱氨酸定點插入、非天然氨基酸定點插入、酶介導以及N-糖鏈介導的偶聯(lián)技術(shù)等。目前采用定點偶聯(lián)的ADC藥物均處于臨床前或臨床研究階段。
4.1 表面賴氨酸側(cè)鏈氨基介導的偶聯(lián)技術(shù)
賴氨酸殘基的一些特性使其成為蛋白質(zhì)生物偶聯(lián)的首選：a. 在蛋白質(zhì)包括抗體中廣泛存在；b. 在蛋白質(zhì)表面分布較多且易于接觸；c. 其側(cè)鏈ε位氨基具備良好的化學反應(yīng)活性。利用具備反應(yīng)活性的羧酸酯基團，如氮-羥基琥珀酰亞胺（NHS）的鏈接體，即可與賴氨酸的ε位氨基反應(yīng)形成共價鍵實現(xiàn)小分子偶聯(lián)，操作過程簡單易行。這些優(yōu)點使得它成為蛋白質(zhì)標記的常用手段，早期的ADC藥物也采用此類偶聯(lián)技術(shù)，如Mylotarg®和Besponsa®，而且后來的Kadcyla®和2022年獲批的Elahere®也是采用此技術(shù)。
由于IgG分子上大約有80~90個賴氨酸殘基，其中有約一半是可以被修飾的，此種偶聯(lián)技術(shù)雖然可以通過控制反應(yīng)條件來控制平均DAR值，但是控制偶聯(lián)位點就很困難，而導致其單個抗體上可能出現(xiàn)的偶聯(lián)位點組合如果按照完全隨機的理論計算可高達數(shù)百萬種，此類ADC藥物的載藥量分布不均一，成為由不同載藥量的偶聯(lián)物亞群組成的混合物，而不同的載藥量，會對ADC的藥效和藥代動力學特性產(chǎn)生影響。另外，由于賴氨酸分布在整個抗體表面，偶聯(lián)如果發(fā)生在抗原抗體結(jié)合域，就有可能干擾ADC與靶點抗原的結(jié)合能力。盡管此技術(shù)存在天生的產(chǎn)生不均一性偶聯(lián)的特點，近些年對Kadcyla®（T-DM1）結(jié)構(gòu)的深入研究顯示，通過合理的工藝設(shè)計和深度工藝開發(fā)，在合理的工藝控制條件下，仍能將批次間以及不同生產(chǎn)規(guī)模的ADC產(chǎn)物中偶聯(lián)位點分布和載藥量保持高度一致，這也就是應(yīng)用該技術(shù)的Mylotarg®、Besponsa®、Kadcyla®和Elahere®能開發(fā)成功的關(guān)鍵之一。采用此技術(shù)的ADC會根據(jù)鏈接體和毒素小分子的特性以及工藝的可控性和收率等，去選擇使用一步法或者兩步法來合成ADC分子（圖3a）。一步法是先將鏈接體和毒素小分子連接，再通過鏈接體上的反應(yīng)基團與抗體表面的賴氨酸側(cè)鏈氨基偶聯(lián)；而兩步法則使用具備雙功能基團的鏈接體上的一個反應(yīng)基團與抗體上賴氨酸側(cè)鏈氨基偶聯(lián)完成抗體修飾，之后鏈接體上的另一個功能基團再與毒素小分子偶聯(lián)制成ADC分子。
4.2 抗體鏈間二硫鍵介導的偶聯(lián)技術(shù)
半胱氨酸殘基由于其還原狀態(tài)的巰基具備極強的親核性，使它成為另一個特殊屬性的生物偶聯(lián)媒介。以IgG1為例，它總共含有16對二硫鍵，其中12對為鏈內(nèi)二硫鍵包裹在其結(jié)構(gòu)內(nèi)部而不易修飾，而4對鏈間二硫鍵則暴露于溶液中可以被還原劑打開（圖3b），從而產(chǎn)生最多8個可供反應(yīng)的自由巰基。雖然通過控制還原劑的比例可以很好地控制產(chǎn)物的平均DAR值，但是除了完全打開4對二硫鍵并全部偶聯(lián)上毒素小分子的ADC藥物（如Enhertu®和二硫鍵橋接技術(shù)介導的ADC），其他通過部分還原和偶聯(lián)的ADC其載藥量分布依然是非均一的。不過得益于有限數(shù)量的巰基，其異質(zhì)性要遠低于賴氨酸介導的偶聯(lián)，主要的載藥量組分（isomer）是載有0、2、4、6、8個小分子的組分。利用巰基的偶聯(lián)反應(yīng)，通常通過與氮取代的馬來酰胺基團產(chǎn)生1,4位的Michael加成反應(yīng)來實現(xiàn)，這個反應(yīng)速度快且反應(yīng)條件溫和，很適用于偶聯(lián)反應(yīng)。
有研究表明采用此類偶聯(lián)技術(shù)的ADC可能會由于打開抗體的鏈間二硫鍵而導致抗體的完整性和穩(wěn)定性受到影響，但是Seagen公司的科學家們通過對CD30靶向的Adcetris®藥物分子深入的結(jié)構(gòu)研究發(fā)現(xiàn)，盡管將IgG1抗體的四對鏈間二硫鍵都打開，偶聯(lián)上8個MMAE毒素小分子對抗體的高級結(jié)構(gòu)僅引起微小的變化，而且這些變化對ADC的整體穩(wěn)定性并無實際意義的影響，當然這種偶聯(lián)方式是否會對抗體的完整性和穩(wěn)定性造成影響可能不能一概而論，而是需要對各自的ADC藥物分子及其抗體在偶聯(lián)前后進行仔細的結(jié)構(gòu)分析對比。此類偶聯(lián)技術(shù)的另一個需要關(guān)注的點是，其偶聯(lián)化學基團巰基琥珀酰亞胺有發(fā)生反Michael加成反應(yīng)的傾向，從而使所偶聯(lián)的小分子轉(zhuǎn)移至血清中帶巰基的蛋白質(zhì)上，影響其血漿中穩(wěn)定性。但是，抗體鏈間二硫鍵介導的偶聯(lián)技術(shù)對比其他技術(shù)，有著許多明顯的優(yōu)點，比如其生產(chǎn)工藝相對簡單，反應(yīng)條件易于控制以及得率高等，使之成為目前ADC藥物開發(fā)中應(yīng)用最為廣泛的技術(shù)。目前已上市的14款A(yù)DC藥物中有9款采用此技術(shù)。
另外，利用抗體鏈間二硫鍵介導的偶聯(lián)也能實現(xiàn)定點偶聯(lián)，如將IgG1的全部8個經(jīng)過鏈間二硫鍵還原后的巰基都偶聯(lián)上毒素小分子的Enhertu®，還有就是鏈間二硫鍵橋接技術(shù)。
二硫鍵橋接技術(shù)通過還原劑將IgG1的4對鏈間二硫鍵完全打開，再采用帶有兩個可與巰基反應(yīng)基團的叉狀雙接頭，同時與打開的一對鏈間二硫鍵反應(yīng)，將打開的二硫鍵通過鏈接體上的雙接頭重新鏈接起來，實現(xiàn)一對鏈間二硫鍵一個鏈接體分子，同時恢復(fù)了抗體的鏈間連接和結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性（圖3c）。而載藥量則由每個鏈接體上攜帶的細胞毒分子數(shù)量所決定，可以為4、8或16。此類技術(shù)無需基因工程改造，使用天然的鏈間二硫鍵就可以實現(xiàn)，但是需要設(shè)計合適的攜帶雙巰基反應(yīng)基團的鏈接體。目前有多種二硫鍵橋接定點偶聯(lián)技術(shù)，如雙砜（bis-sulfones）技術(shù)、下一代馬來酰胺（next-generation maleimides，NGMs）技術(shù)、馬來酰肼（pyridazinediones，PDs）技術(shù)以及 C-LockTM技術(shù)，都已被用于ADC藥物開發(fā)和探索中。采用雙砜技術(shù)偶聯(lián)產(chǎn)生的符合預(yù)期的一對鏈間二硫鍵一個鏈接體分子的組分大約占比75%~85%，需要進一步使用疏水層析純化，才可使目標組分達到95%以上。OBI Pharma公司運用雙砜技術(shù)將MMAE偶聯(lián)至抗-GloboH的抗體上開發(fā)出ADC藥物候選分子OBI-999，用于治療胰腺癌和胃癌，目前正在臨床研究中。也正是在對此分子的結(jié)構(gòu)研究中發(fā)現(xiàn)這一ADC中存在兩種異構(gòu)體，一種是完全按照天然抗體二硫鍵重新橋接的方式，另一種則是一種“半抗體形式”，即重鏈鉸鏈區(qū)的二硫鍵經(jīng)橋接后形成了鏈內(nèi)橋接形式，而兩個重鏈間則是分離狀態(tài)，無共價鍵結(jié)合，目前尚不知此異構(gòu)體是否會影響藥效。而NGMs技術(shù)偶聯(lián)產(chǎn)物，也與雙砜技術(shù)一樣，存在兩種偶聯(lián)異構(gòu)體，一種是天然抗體形式，另一種則是“半抗體形式”，同樣也會跟常規(guī)的馬來酰胺一樣在血液中發(fā)生巰基交換反應(yīng)而導致小分子提前釋放，目前此類偶聯(lián)技術(shù)的ADC尚未進入臨床研究中。馬來酰肼技術(shù)比起前兩種技術(shù)的優(yōu)勢在于，其制成的偶聯(lián)產(chǎn)物血清穩(wěn)定性較好，而且此類偶聯(lián)物目標產(chǎn)物——天然二硫鍵橋接形式的ADC占比可達90%以上，因此被認為是目前最佳的二硫鍵橋接方式之一。而 C-LockTM技術(shù)則是由Concortis Biotherapeutics所開發(fā)，其代表作為Sorrento Therapeutics 所開發(fā)的STI-6129和Zova Biotherapetics所開發(fā)的ZV0508，分別靶向CD38和5T4，毒素小分子均為多司他汀（Duostatin）。二硫鍵橋接技術(shù)目前仍在不斷推陳出新，期望能解決偶聯(lián)橋接導致的“半抗體”異構(gòu)體問題，改善血清穩(wěn)定性，提高此類ADC的安全性和有效性。
4.3 工程化半胱氨酸定點偶聯(lián)技術(shù)
工程化半胱氨酸偶聯(lián)技術(shù)是在抗體表面指定位點引入半胱氨酸而實現(xiàn)定點和均一性偶聯(lián)的一類技術(shù)（圖3d），如Genentech公司的THIOMABTM技術(shù)。在一份發(fā)表的研究中，通過基因工程技術(shù)將半胱氨酸通過點突變的形式引入到一個抗MUC16靶點的單抗重鏈114位（A144C），通過CHO細胞表達純化后，經(jīng)過TCEP部分還原將114位的半胱氨酸的巰基暴露出來，再以硫酸銅氧化被打開的鏈間二硫鍵，最后再與攜帶有馬來酰胺基團的小分子vcMMAE反應(yīng)，所產(chǎn)生的ADC藥物平均DAR值為1.6。THIOMABTM ADC與通過鏈間二硫鍵介導的DAR值為3.1的ADC相比，盡管載藥偏低但是其體內(nèi)動物模型藥效并無區(qū)別，且展現(xiàn)出了更好的安全性，同時血清清除率要遠低于非均一ADC，而且THIOMABTM ADC經(jīng)過工藝優(yōu)化后可以達到平均DAR為2，產(chǎn)物中DAR2的組分占比超過90%。THIOMABTM和其他一些類似技術(shù)在進行偶聯(lián)前，均需要通過還原去除抗體在細胞培養(yǎng)過程中所引入的半胱氨酸上的配基。有意思的是，一篇文獻報道，在赫賽汀的輕鏈124位（Q124C）突變引入半胱氨酸，這種抗體表達后純化時其124位半胱氨酸由于空間位阻的原因而沒有和配基結(jié)合，因此可以直接用于偶聯(lián)反應(yīng)，而且其偶聯(lián)產(chǎn)物均一，DAR值為2，這一發(fā)現(xiàn)對于進一步優(yōu)化THIOMABTM技術(shù)，簡化生產(chǎn)工藝有所啟迪。另外還有一些與THIOMABTM類似的技術(shù)，如通過基因工程在特定位點插入半胱氨酸而不是由點突變獲得，還有在多個位點同時引入半胱氨酸以增加載藥量的嘗試。該技術(shù)已在體內(nèi)外臨床前研究中展示了其療效和安全性，目前已有使用此類技術(shù)的ADC藥物進入臨床研究中。近期，輝瑞公司研究發(fā)現(xiàn)了一種新型的制備此類ADC的生產(chǎn)技術(shù)，避免了先完全還原后氧化工藝，采用一步法實現(xiàn)定點偶聯(lián)，簡化工藝的同時降低了還原氧化過程產(chǎn)生的抗體二硫鍵錯配等風險。他們運用一種含有Ellman試劑DTNB（5,5'-二硫雙（2-硝基苯甲酸））的培養(yǎng)基來表達生產(chǎn)含有工程化半胱氨酸突變的抗體，使得生產(chǎn)出來的抗體其半胱氨酸上的巰基保護基團為TNB而不是半胱氨酸或谷胱甘肽。此TNB與半胱氨酸形成的二硫鍵，能被具備溫和還原能力的還原劑TSPP（三苯基膦三間磺酸鹽）還原，而同時抗體的鏈間二硫鍵依然保持穩(wěn)定，還原產(chǎn)生的巰基與鏈接體-毒素小分子偶聯(lián)即可形成定點偶聯(lián)ADC。此技術(shù)產(chǎn)出的ADC藥效與采用常規(guī)THIOMABTM技術(shù)的ADC等同，卻不含有THIOMABTM技術(shù)制成的ADC中常見的二硫鍵錯配異構(gòu)體以及片段。
在開發(fā)工程化半胱氨酸偶聯(lián)技術(shù)時，半胱氨酸引入的位點選擇對于ADC的藥代動力學特性和毒副作用都有影響，因此需要謹慎篩選合適的位點來進行基因工程改造和偶聯(lián)。如Ma等在一個人源化抗IL13Rα2（interleukin 13 receptor subunit alpha 2）抗體的恒定區(qū)引入了一系列的半胱氨酸突變，然后利用這些工程化的抗體制備ADC，之后在大鼠和小鼠中對這些ADC進行了藥效、藥代動力學和毒理研究。結(jié)果顯示，所有的定點偶聯(lián)ADC都比常規(guī)ADC有更好的體內(nèi)藥效和耐受性，而不同位點偶聯(lián)的ADC之間則展現(xiàn)了出了不同的血清清除率和脫靶毒性，某些位點偶聯(lián)的ADC（L443C）比起其他的具備更低毒副作用和更長的半衰期。
4.4 非天然氨基酸定點偶聯(lián)技術(shù)
非天然氨基酸定點偶聯(lián)技術(shù)的核心是通過基因工程技術(shù)以及對表達體系的tRNA編碼改造，將帶有反應(yīng)活性基團的非天然氨基酸引入到抗體的預(yù)定位置，從而介導定點偶聯(lián)（圖3e）。此類技術(shù)比較常用的非天然氨基酸有對乙酰苯丙氨酸、疊氮取代甲基苯丙氨酸和疊氮取代型賴氨酸。運用此類技術(shù)開發(fā)的ADC分子，已被證明具備高均一性的載藥量和載藥分布，且具備優(yōu)秀的活性和穩(wěn)定性，其安全性也很好，因此吸引了很多學術(shù)界和醫(yī)藥生物技術(shù)公司對此類技術(shù)進行探索和開發(fā)。目前采用此類技術(shù)的代表性ADC藥物是Ambrx和浙江醫(yī)藥聯(lián)合開發(fā)的ARX788，ARX788的靶點是HER2，運用的非天然氨基酸是對乙酰苯丙氨酸，通過肟鍵與鏈接體藥物結(jié)合，采用的鏈接體為不可剪切的聚乙二醇，毒素小分子為Amberstatin，平均載藥量為1.9。此外，生物技術(shù)公司Sutro也有兩個采用此類技術(shù)的ADC藥物分子處于臨床研究中，分別是STRO-001和STRO-002，它們運用的非天然氨基酸為疊氮取代甲基苯丙氨酸，通過點擊化學（click-chemistry）反應(yīng)完成偶聯(lián)。STRO-001是以抗CD74抗體為載體通過一種不可剪切的鏈接體與美登素偶聯(lián)而成，平均載藥量為2，臨床研究的適應(yīng)癥為DLBCL。STRO-2則是靶向葉酸受體的ADC，運用可剪切VC（valine-citrulline）鏈接體及微管抑制劑SC209為毒素小分子，平均載藥量為4，臨床I期研究的結(jié)果顯示此ADC具有良好的耐受性、可控的副反應(yīng)，以及治療卵巢癌的潛力。除了這些ADC分子外，還有其他一些采用非天然氨基酸定點偶聯(lián)的ADC藥物處于臨床前研究中，而且采用此類技術(shù)開發(fā)ADC的項目仍在快速增加中。但是此類ADC技術(shù)的缺點也很明顯，攜帶非天然氨基酸的抗體表達量通常偏低，成本較高，且引入非天然氨基酸可能會產(chǎn)生免疫原性增高的風險。
4.5 酶介導的定點偶聯(lián)技術(shù)
酶類由于具備很好的位點或氨基酸序列選擇性，且其最佳活性條件與抗體的舒適條件一致，因此也被廣泛用于介導定點偶聯(lián)。酶類或者通過直接將小分子藥物轉(zhuǎn)移至特定氨基酸序列上，或者通過將含反應(yīng)基團的鏈接體引入到抗體特定位點從而達成定點偶聯(lián)（圖3f）。目前比較常見的用于定點偶聯(lián)的酶有谷氨酰胺轉(zhuǎn)移酶（transglutaminase，TG）和甲酰甘氨酸生成酶（formylglycine-generating enzyme，F(xiàn)GE）。谷氨酰胺轉(zhuǎn)移酶能特異性介導蛋白質(zhì)中谷氨酰胺末端的甲酰胺與賴氨酸上的側(cè)鏈氨基反應(yīng)形成共價鍵，其中微生物來源的谷氨酰胺轉(zhuǎn)移酶（mTG）在介導偶聯(lián)方面最為常用。mTG介導的定點偶聯(lián)策略有4種：第一種采用基因工程技術(shù)或糖苷酶解將抗體上糖苷切除，使295位上的谷氨酰胺暴露以供mTG修飾；第二種是運用基因工程技術(shù)將mTG特異識別序列（如LLQG等）添加到重鏈或輕鏈的C端以供mTG定點偶聯(lián)；第三種則可直接利用抗體末端賴氨酸殘基或者利用基因工程在末端引入賴氨酸殘基再利用mTG來修飾；最后一種是將這幾種方法組合，以達到增加偶聯(lián)位點和載藥量的目的。在將修飾基團引入特定位點后，可以采用前述的各種偶聯(lián)化學反應(yīng)，如click反應(yīng)和Michael加成反應(yīng)等，實現(xiàn)毒素小分子的定點偶聯(lián)。采用mTG修飾的ADC目前均在研究探索階段，一些研究顯示對比常規(guī)ADC，其在動物模型中的腫瘤抑制活性更好且持續(xù)時間更長。
甲酰甘氨酸生成酶（FGE）能將特定序列CXPXR（X可為任意氨基酸除了脯氨酸）中的半胱氨酸殘基進行氧化生產(chǎn)甲酰甘氨酸，甲酰甘氨酸上的醛基可與帶有肼或者羥胺基團的小分子藥物偶聯(lián)。這一技術(shù)被稱為SMARTag®技術(shù)，它通過將SMARTag®（CXPXR）整合至抗體的特定位置，如輕鏈或重鏈的C端，接著以FGE處理產(chǎn)生反應(yīng)基團，介導定點偶聯(lián)。利用這一技術(shù)的ADC目前有一款進入了臨床研究階段，其靶標為CD22，在抗體兩個重鏈C端連接有SMARTag®，通過不可剪切鏈接體與美登素偶聯(lián)，在臨床前和I期臨床試驗中均展現(xiàn)出良好的療效和安全性。
4.6 糖鏈介導的定點偶聯(lián)技術(shù)
在所有抗體的重鏈CH2區(qū)域都有一個保守的N-糖鏈位點，N-297。利用N-糖鏈來介導偶聯(lián)具有先天優(yōu)勢。首先N-糖鏈的位點遠離抗體的抗原抗體結(jié)合區(qū)，此處偶聯(lián)一般不會干擾其抗原結(jié)合能力；其次，N-糖基化的方式在各種抗體都十分保守，利于糖鏈修飾技術(shù)在不同種抗體中的應(yīng)用，且無需基因工程改造，使用天然抗體即可；再者就是糖鏈是由碳水化合物組成，理化性質(zhì)與蛋白質(zhì)和氨基酸截然不同，因此從化學反應(yīng)的角度利于偶聯(lián)位點的特異性。糖鏈定點偶聯(lián)技術(shù)主要有通過氧化修飾和糖苷酶修飾兩種途徑。糖苷氧化修飾技術(shù)主要用于抗體標記，通過高濃度氧化劑作用于糖鏈末端的糖苷的二醇基團使之產(chǎn)生醛基，再用含肟或者羥胺基團的鏈接體小分子與之反應(yīng)，實現(xiàn)定點偶聯(lián)。由于期間需要使用高濃度的氧化劑，如NaIO4，對抗體的氨基酸殘基的破壞會導致理化性質(zhì)甚至藥代動力學特性發(fā)生改變，因此很少用于ADC藥物的開發(fā)。目前用于ADC藥物開發(fā)的主流的糖鏈偶聯(lián)技術(shù)大都采用糖苷酶技術(shù)，其中最為成熟的當屬荷蘭Synaffix公司開發(fā)的GlycoConnectTM技術(shù)，目前已授權(quán)全球多家ADC藥物開發(fā)企業(yè)，多個產(chǎn)品也正在開展臨床研究。該技術(shù)首先使用糖苷內(nèi)切酶將糖鏈切除只剩余最核心的氮乙酰葡萄糖胺，再使用糖苷轉(zhuǎn)移酶將攜帶有反應(yīng)基團的糖苷衍生物（如疊氮取代的乙酰半乳糖胺）結(jié)合至核心糖苷上完成定點修飾，最后以click化學反應(yīng)與鏈接體藥物反應(yīng)，達成糖鏈介導的定點偶聯(lián)（圖3g）。采用GlycoConnectTM技術(shù)的ADC有兩個偶聯(lián)位點，其載藥量取決于每個鏈接體攜帶的小分子藥物的數(shù)量，其修飾和偶聯(lián)效率可以達到90%以上，在體內(nèi)和體外實驗中展現(xiàn)出優(yōu)于常規(guī)ADC的藥效和循環(huán)系統(tǒng)穩(wěn)定性。另外還有一些糖苷酶介導的偶聯(lián)技術(shù)，其技術(shù)路線與GlycoConnectTM相似，只是將攜帶反應(yīng)基團的糖苷更換為糖鏈，又或者采用半乳糖苷酶將糖鏈末端的半乳糖切除，再以轉(zhuǎn)移酶將糖苷或糖鏈衍生物連接到抗體糖鏈末端；還有一種就是在抗體表達過程中用帶反應(yīng)基團的巖藻糖衍生物替換天然的巖藻糖，將其引入到糖鏈巖藻糖的位點以實現(xiàn)定點修飾和偶聯(lián)。糖鏈定點偶聯(lián)技術(shù)由于上述的天然優(yōu)勢，使之成為定點偶聯(lián)技術(shù)的重要發(fā)展方向。然而，這類技術(shù)也有其相應(yīng)的限制，如需要特殊的試劑和糖苷酶，而且由于偶聯(lián)位點只有兩個，因此其載藥量選擇較少，而且糖鏈被修飾后對ADC整體藥效和藥代動力學的影響還需要進一步研究和評估。
5、ADC藥物未來發(fā)展方向
從第一個ADC藥物在2000年獲批上市到現(xiàn)在的20多年間，共計14款A(yù)DC藥物獲批上市，這期間ADC藥物已經(jīng)在偶聯(lián)技術(shù)、鏈接體和毒素小分子方面取得顯著發(fā)展，使得其療效和安全性得到了很大的提高，也吸引了學術(shù)界和工業(yè)界對該領(lǐng)域的持續(xù)關(guān)注和研究投入，同時使得ADC技術(shù)得到了更進一步的快速發(fā)展，為未來ADC藥物的設(shè)計和開發(fā)提供了廣闊的前景。
在ADC藥物的靶點選擇方面，除了腫瘤細胞表面靶點外，腫瘤微環(huán)境的靶點是該領(lǐng)域的新熱點之一。此類靶點通常包括腫瘤微環(huán)境（tumor microenvironment，TME）中的表皮細胞和成纖維細胞抗原。此類靶點，因其分布在腫瘤組織周圍，比腫瘤組織更容易從血液循環(huán)接觸到ADC分子；再者，此類組織細胞比起腫瘤細胞受到基因突變影響小的多，因此產(chǎn)生耐藥性的可能性也降低；作用于此類靶點除了能運用毒素小分子殺傷腫瘤細胞外，還可能產(chǎn)生抗血管生成等協(xié)同抑制腫瘤增殖的作用；最重要一點，TME抗原很少或者幾乎不在正常組織表達。LRRC15（leucine-rich repeat containing 15）就是此類靶點的代表，它在多種腫瘤的微環(huán)境里的成纖維細胞膜表面有高表達，而在正常組織不表達。艾伯維公司的ABBV-085則是針對LRRC15開發(fā)的新型ADC，由抗LRRC15抗體和MMAE偶聯(lián)而成，在含有LRRC15陽性基質(zhì)的腫瘤中展現(xiàn)了良好的活性和安全性。另一種腫瘤基質(zhì)靶點的ADC，則同時運用了另一種新型毒素小分子釋放機制——非內(nèi)吞依賴性的釋放，如靶向腫瘤組織中的不溶性纖維蛋白（insoluble fibrin，IF）的一種ADC，運用抗IF抗體和MMAE經(jīng)血纖維蛋白溶酶特異性剪切的肽段偶聯(lián)而成，動物實驗研究結(jié)果顯示它僅在與IF結(jié)合后釋放MMAE，而釋放的MMAE除了殺傷腫瘤細胞外還能破壞腫瘤中的血管，起到協(xié)同殺傷作用，展示了其開發(fā)潛力。
在ADC藥物的靶點選擇方面，除了腫瘤細胞表面靶點外，腫瘤微環(huán)境的靶點是該領(lǐng)域的新熱點之一。此類靶點通常包括腫瘤微環(huán)境（tumor microenvironment，TME）中的表皮細胞和成纖維細胞抗原。此類靶點，因其分布在腫瘤組織周圍，比腫瘤組織更容易從血液循環(huán)接觸到ADC分子；再者，此類組織細胞比起腫瘤細胞受到基因突變影響小的多，因此產(chǎn)生耐藥性的可能性也降低；作用于此類靶點除了能運用毒素小分子殺傷腫瘤細胞外，還可能產(chǎn)生抗血管生成等協(xié)同抑制腫瘤增殖的作用；最重要一點，TME抗原很少或者幾乎不在正常組織表達。LRRC15（leucine-rich repeat containing 15）就是此類靶點的代表，它在多種腫瘤的微環(huán)境里的成纖維細胞膜表面有高表達，而在正常組織不表達。艾伯維公司的ABBV-085則是針對LRRC15開發(fā)的新型ADC，由抗LRRC15抗體和MMAE偶聯(lián)而成，在含有LRRC15陽性基質(zhì)的腫瘤中展現(xiàn)了良好的活性和安全性。另一種腫瘤基質(zhì)靶點的ADC，則同時運用了另一種新型毒素小分子釋放機制——非內(nèi)吞依賴性的釋放，如靶向腫瘤組織中的不溶性纖維蛋白（insoluble fibrin，IF）的一種ADC，運用抗IF抗體和MMAE經(jīng)血纖維蛋白溶酶特異性剪切的肽段偶聯(lián)而成，動物實驗研究結(jié)果顯示它僅在與IF結(jié)合后釋放MMAE，而釋放的MMAE除了殺傷腫瘤細胞外還能破壞腫瘤中的血管，起到協(xié)同殺傷作用，展示了其開發(fā)潛力。
由于目前限制ADC效力的一個重要因素是其分子尺寸太大，使之不容易穿透毛細血管以及腫瘤基質(zhì)等屏障到達腫瘤細胞，從而阻礙了其在實體瘤治療方面的效果。因此，針對這一局限性，研究者們嘗試了各種手段縮小ADC尺寸，包括前述的抗體片段或納米抗體等形式的ADC。此外，還有一類利用更小尺寸非抗體框架的ADC，其抗體部分由一段有靶向結(jié)合能力的多肽替代以進一步增加其穿透力，這一多肽由化學合成得到。目前已報道的最小分子質(zhì)量的一類多肽框架ADC，是一類被稱為雙環(huán)多肽（bicyclic peptide）的肽段，分子質(zhì)量僅1.5~2 ku，其次是一類被稱為“Pentarin”的分子，分子質(zhì)量為2~5 ku，二者分別由生物技術(shù)公司Bicycle Therapeutics和Tarveda公司所開發(fā)的技術(shù)，其代表性ADC產(chǎn)品分別是BT5528和PEN-221。BT5528的靶點為EphA2（Ephrin A2）受體，由靶向EphA2的雙環(huán)多肽與MMAE偶聯(lián)而成，其與靶點的親和力 1.9 nmol/L。小鼠荷瘤實驗研究結(jié)果顯示，它能快速被腫瘤吸收且能持續(xù)地聚集在腫瘤組織中。而且臨床前毒理實驗顯示，它沒有觀察到同靶點常規(guī)ADC MEDI-547的相關(guān)毒性，該分子目前在臨床研究中。而PEN-221目前也在臨床研究中，它是由靶向生長激素抑制受體2（SSTR-2）的奧曲肽衍生物與DM1偶聯(lián)形成，它與靶點的親和力很高在 51 pmol/L左右。動物實驗結(jié)果顯示1~2 mg/kg的劑量下就能很好地抑制肝腫瘤和肺腫瘤，且在I期臨床試驗中已展現(xiàn)出其療效和安全性。此類ADC開發(fā)的最大挑戰(zhàn)就是其血液清除率太快，將來如能克服此缺點將會進一步拓展其治療適應(yīng)癥，如腦腫瘤和一些血管分布很少的實體瘤。
另一些嘗試主要是在載荷方面，如通過在抗體上偶聯(lián)兩種不同的細胞毒小分子，以應(yīng)對腫瘤組織中癌細胞的高度異質(zhì)性和耐藥性。Seagen公司的研究者們通過在抗CD30抗體cAC10上同時偶聯(lián)上MMAE和MMAF，首次在動物實驗中展現(xiàn)出了雙載荷ADC能有效地殺傷對MMAE-ADC有耐藥性的腫瘤細胞。Yamazaki和同事則將此研究更進一步，利用定點偶聯(lián)技術(shù)，以及含多載荷連接位點的鏈接體，可以調(diào)整兩種不同細胞毒小分子的比例，構(gòu)建出MMAE+MMAF分別為2+2、4+2和2+4等組合的HER2靶向ADC分子。動物實驗顯示，雙載荷ADC比起單載荷ADC或者聯(lián)合使用兩種單載荷ADC，針對HER2陽性的雜合型加復(fù)發(fā)性乳腺癌腫瘤組織有更好的療效，且不同的載荷比例顯示不同的抗腫瘤活性，為將來克服腫瘤的異質(zhì)性和耐藥性提供了一種新的思路。
此外，還有將ADC中傳統(tǒng)的細胞毒小分子載荷替換為蛋白毒素、細胞因子、蛋白降解靶向嵌合體（proteolysis-targeting chimeras，PROTAC）和小核酸作為載荷，用于治療癌癥和其他疾病。如Avidity Biosciences的AOC 1001靶向肌肉組織上靶點TfR1（transferrin receptor 1），其siRNA作用于DMPK mRNA，用于治療一種罕見的肌肉病變。目前這些種類的偶聯(lián)藥物還處于早期研發(fā)階段，有的已經(jīng)開始進入臨床研究階段，有的才剛剛完成概念驗證，都還面臨各種各樣的挑戰(zhàn)，相信將來隨著各種技術(shù)的進步和成熟，特別是對疾病機理的更深入理解，加上人工智能輔助藥物設(shè)計技術(shù)等，這些新形式的ADC藥物會得到進一步的發(fā)展，造福更多患者。
6、結(jié)論
ADC藥物設(shè)計的本質(zhì)是利用抗體的高選擇性靶向運輸能力將具有生物學效應(yīng)的小分子藥物，如細胞毒小分子藥物高效地遞送至病灶發(fā)揮治療作用，既是一種新型藥物分子，又是一種靶向遞送系統(tǒng)。在這一體系內(nèi)，抗體、鏈接體、小分子以及偶聯(lián)技術(shù)等關(guān)鍵要素都需要作為一個整體來綜合考慮，針對靶點的生物學特征以及疾病的特性和機理，選擇合適的組件和技術(shù)對于開發(fā)成功的ADC藥物至關(guān)重要。為了進一步發(fā)掘ADC藥物的潛力，國內(nèi)外在各個關(guān)鍵要素上都正在進行大量的研究，為開發(fā)新一代的ADC藥物持續(xù)充實工具庫，并提供源源不斷的新思路。這些新思路包括：選擇靶向腫瘤微環(huán)境的抗體并結(jié)合使用細胞外釋放機制的鏈接體藥物，解決靶點相關(guān)的耐藥性；使用分子質(zhì)量較小的抗體片段或者納米抗體開發(fā)ADC，提高腫瘤組織穿透力；選擇親水性更好的鏈接體改善ADC的載藥量和理化性質(zhì)；使用不同作用機制的小分子藥物，降低毒副作用并拓展ADC藥物的應(yīng)用領(lǐng)域；選擇定點偶聯(lián)技術(shù)改善載藥均一性和藥代動力學特性等。相信在ADC領(lǐng)域研究者的共同努力下，克服現(xiàn)有ADC的缺點和挑戰(zhàn)，下一代的ADC藥物將會給腫瘤的靶向治療帶來新驚喜，使更多的腫瘤患者獲益。另外，作為一種遞送系統(tǒng)，相信將來ADC藥物必將用于更加廣泛的領(lǐng)域，如中樞神經(jīng)疾病、遺傳疾病和感染性疾病等領(lǐng)域，作為真正高效的“魔法子彈”去消滅疾病，拯救生命。
參考來源：生物化學與生物物理學進展. 劉文超, 李鴻峰 ,胡朝紅.
