摘 要
本文將對自身對照法的原理及應用進行詳細的討論，并重點分析其中存在的無法避免的系統誤差以及由于該系統誤差導致的不適用情況。
1、概述
自身對照法是一種常見的雜質含量計算方法，測定雜質含量時，將供試品溶液按一定的稀釋倍數稀釋作為對照溶液，稀釋倍數一般為100倍、500倍、1000倍等。中國藥典收載的質量標準正文中有關物質的雜質含量計算方法絕大多數是自身對照法。自身對照法一般可分為加校正因子的自身對照法與不加校正因子的自身對照法。加校正因子的自身對照法適用于已知雜質（校正因子在0.2-5之間）的計算，不加校正因子的自身對照法適用于響應與主成分接近（國內要求校正因子在0.9-1.1之間，歐美要求0.8-1.2）的已知雜質與未知雜質的含量計算。
2、自身對照法的系統誤差分析
自身對照法在計算雜質含量時，存在兩個無法避免的系統誤差：流動相本底吸收；供試品雜質含量。
（1）流動相本底吸收
流動相的本地吸收將影響自身對照法的計算結果，且為系統誤差，非隨機誤差。假設待測雜質與主成分響應一致，流動相本底吸收為n，對照溶液主成分吸收為a，待測雜質吸收為A,稀釋倍數為k，待測雜質的真實含量為A/ka，而自身對照法計算的雜質含量為（A-n）/ka（a-n）。計算結果減去真實結果的差值為（A-a）n/ka（a-n），由于對照溶液主成分的吸收a一定大于流動相本底吸收n，否則該方法不適用；因此由該公式可看出，當A=a時，計算結果與真實結果一致；當A＞a時，即對照溶液主成分濃度小于待測雜質濃度時，差值為正值，計算結果大于真實結果；當A＜a時，計算結果小于真實結果。
計算結果不得小于真實結果，因此對照溶液主成分濃度不得大于待測雜質濃度，由此可得出對照溶液濃度不得超過待測雜質限度濃度的結論。從這個角度看，如雜質限度為0.1%，則對照溶液應為供試品稀釋1000倍，不應使用1%自身對照溶液。
從以上討論也可推測，自身對照法計算回收率時，回收率應與濃度呈正相關，流動相本底吸收較大的情況下，低濃度如定量限回收率偏低的風險較大。
該誤差雖不能完全消除，但可通過優化色譜條件較少，即檢測波長如遠大于流動相的截止波長，且待測組分的響應較強，流動相本底吸收可忽略不計，為了操作便利，在回收率符合要求的前提下，對照溶液可選擇1%供試品溶液。
（2）供試品雜質含量
假設一種極端情況，所有的雜質與主成分響應一致，供試品中含有50%的雜質，則雜質響應與主成分一致，通過自身對照法計算的雜質含量為100%。這個結果可以說非常荒謬，但是闡述了一個顯然的事實，自身對照法由于供試品中雜質的存在，使得檢測結果高于真實值，如雜質含量高到一定程度，檢測結果將偏高到無法接受。
假設所有的雜質與主成分響應一致，總雜含量為s，總峰面積為A，則自身對照法計算的總雜含量為As/A（1-s），減去真實總雜含量s，差值為s×s/（1-s），由差值公式可看出，當總雜含量s無限趨近于0時，自身對照法的計算結果與真實值一致；總雜真實值最大值為1，當總雜含量無限趨近于1時，自身對照法的計算結果為無窮大。
由以上分析可看出，當雜質含量較高時，無法忽略自身對照法的系統誤差帶來的計算結果偏大的影響。如計算降解試驗的質量守恒，如主成分降解超過20%，采用自身對照計算，總雜含量將偏大4%，這很可能導致質量守恒驗算不符合要求。筆者認為，對于雜質含量較大的供試品，如總雜超過5%，不建議使用自身對照法計算雜質含量，此處的總雜是廣義上的總雜，包括殘留溶劑、水分、有關物質等；該情況下可采用主成分外標法或者面積歸一化法。
3、后述
自身對照法具有不用使用對照品，在樣品較少的情況下操作便利的優點，但是對于多個樣品，制備對照溶液較為繁瑣，不如主成分外標法方便；且其存在不能克服的系統誤差，因此筆者建議同仁們多嘗試使用主成分外標法計算雜質含量。
