透射電子顯微鏡(Transmission Electron Microscope，TEM)具有很高的分辨率和放大倍數高，廣泛應用于材料科學、地球科學、醫學和生命科學等領域。透射電子顯微鏡與不同附件（X射線能譜分析（EDS）和電子能量損失譜（EELS））相結合，可同時提供形貌，組成和結構信息，它能揭示物質內部微細的觀結構，為人們認識，理解事物微觀結構所必需。透射電鏡觀察的最終目的是獲得清晰的照片，樣品的制備是關鍵。透射電鏡試樣制備質量的好壞直接影響試樣觀察效果和分析結果。
一、 樣品制備的基本要求
（1）樣品被觀察區對入射電子必須是“透明”的。
電子對試樣的穿透能力與試樣自身能量和試樣所含各元素原子序數等因素有關。普通透射電鏡樣品厚度小于100nm。對厚度須在10nm以下的高分辨電鏡試樣。
（2）樣品必須牢固。
為了能夠承受電子束轟擊和防止在搬運時機械振動造成損傷。對于易破損的塊狀試樣，須用銅網粘住，銅網起到加固試樣的作用。對于粉末樣品來說，可以嘗試將粉末樣品分散到帶有支持膜的銅網上（例如，火棉膠膜，微柵膜，超薄炭膜等）。銅網與火棉膠膜起到了支撐，承載與黏附粉末樣品的作用。生物樣品則須固定，硬化后切成超薄切片后放置在覆蓋支持膜的載網中。
（3）樣品必須具有導電性。
對于非導電樣品，應在表面噴一層很薄炭膜，以防止電荷積累而影響觀察。
（4）防止樣品被污染。
制樣時必須將試樣超微結構完整地保留。嚴格防止樣品被污染和樣品結構、性質的改變（如相變、氧化等）。
二、 樣品載網與支持膜的選用
載網一般為多孔金屬片，起到增強、支撐試樣的作用。載網可由Cu,Ni,Mo,Al,W,Au和尼龍制成，但是一般采用Cu,因此統稱為銅網。其規格較多，可以根據試樣的特性選用。多數透射電鏡樣品的制樣過程中，為保證樣品能夠攜帶到“載網”中去，都要在“載網”中覆蓋有機膜，即所謂的“支持膜”。這種帶有支持膜的載網就叫做“載網支持膜等”。
支持膜為一層非晶質的薄膜，厚約20nm。它在電子束照射下應該是“透明的”，本身并無任何結構，且與樣品不會發生反應。
下面具體介紹支持膜的分類。
1.無孔碳支持膜系列
碳支持膜（Formvar Stabilized with Carbon Support Film）就是方華膜（也可用火棉膠）上面再覆一層碳，它是一種最為普遍和廣泛應用的支持膜。噴鍍后碳顆粒更細，一般在1nm以下，最適合在200kV電鏡中觀測納米材料。膜總厚度:10~20nm。
2.純碳支持膜系列
純碳支持膜(Carbon Support FilmwithaＲemovable Formvar Backing)：適合觀察10nm以上的樣品。膜總厚度:20～40nm。推薦選用400目載網。
薄純碳支持膜(Thinner Pure Carbon Support Film)：在操作上膜總厚度:7～10nm(根據實驗要求還可以更薄，達到3～7nm)。推薦選用400目載網。
超薄碳支持膜（Ultrathin Pure Carbon Film with no Formvar Backingon Lacey Carbon Support Film）：特別適用于低襯度的高分辨電鏡，并且是能量過濾（Energy Filtering TEM）檢測的理想載膜。膜厚度在3~5nm之間。建議選擇230目的載網。
3.有孔(微柵)支持膜系列
微柵支持膜(Lacey Support Film)：常見孔徑大約2～8μm。膜厚度15～30nm。推薦選用230目載網。
純碳微柵支撐膜（A Lacey Support Film with a Removable Formvar Backing）：更加方便微束分析或者單顆粒電子衍射像的獲取。膜的總厚度為15~30nm。建議選擇230目的載網。
FIB微柵支持膜(FIB Lacey Support Film)：專用于FIB(聚焦離子束)分析技術領域。膜總厚度15～30nm。推薦選用200目載網。
多孔碳支持膜(Holey Support Film)：膜厚度15～20nm。推薦選用230目載網。
Quantifoil規則多孔支持膜（Quantifoil Micromachined Holey Carbon Support Film）：此種膜還可應用于物質納米特征研究，如生物大分子復合體在載體自由懸層的研究。膜孔徑自定義在1~7μm之間。膜厚度在18~20nm之間。
C-flat純碳多孔支持膜(C-flat Holey Carbon Grids for Cryo-TEM)是應用于Cryo-TEM的首選支持膜。
4.非碳材料支持膜系列
純方華膜(Pure Formvar Support Film Only)：膜厚度10～15nm。推薦選用200目載網。
鍍金支持膜(Formvar Stabilized with Gold Support Film)：便于EDS檢測。膜厚度:10～20nm。推薦選用200目載網。
鍍鍺支持膜(Formvar Stabilized with Germanium Support Film)具有化學性質穩定，襯度好等優點。
氮化硅薄膜窗格（Silicon Nitride Support Film）可以承受1000°C以上的高溫。彈性更好，適合多種樣品制備技術的要求，電子束轟擊時相對穩定，襯度和親水性略低于碳膜。
5.特型載網支持膜系列
除我們常用的圓孔、方孔載網支持膜以外，在特殊應用中還會選用某些特型載網所制成的支持膜。例如光圈載網、狹縫載網和雙聯載網。
三、樣品制備方法
透射電鏡樣品制備是比較復雜的工藝過程，對于獲得良好的TEM像或者衍射譜非常重要。透射電鏡就是利用試樣散射如射電子能力不同來形成襯度的，它需要制備電子束“透明”試樣，并且需要保持較高分辨率且不失真。電子束在固體樣品中的透射能主要取決于加速電壓、樣品厚度和材料的原子序數。通常加速電壓越高、原子序數越小，電子束所能穿透的試樣越厚。對100~200kV透射電鏡來說，需要50~100nm厚的試樣作為高分辨率透射電鏡，試樣厚度需要15nm左右（越薄越好）。
現將透射電子顯微學最常用的幾種制樣方法介紹如下：
1.粉末法
該方法也稱為懸浮液法，適于制備其粉末能為電子穿透的試樣，例如碳黑和粘土礦物。若粉末樣品在半固結的情況下，可用瑪瑙研缽輕輕搗勻，再按照以下步驟進行：首先在粉末樣品上撒上盛有蒸餾水和酒精的水、丙酮或者甘油等容器內，利用超聲波震蕩器振蕩10min左右，使之分散于液體內形成懸浮液。然后用滴管吸出懸浮液使1~2滴移到覆蓋支持膜銅網上。用濾紙吸去液滴，液體充分蒸發后可放入電鏡下觀察。
對于塊狀樣品，也可將其搗碎，然后再按上述方法制樣。必須注意的是:應該“搗碎”，而不是“研碎”，以保留盡可能多的刃邊和尖角———即薄區。
2.化學腐蝕法
此法是利用化學試劑對物質的溶解作用，以達到減薄樣品的目的。通常采用適當濃度的HNO3、HCl等強酸作為化學減薄液。
3. 電解減薄法
該方法只用于金屬、合金等具導電性的試樣制備，通常采用雙噴電解減薄儀。減薄儀包括電解槽，馬達箱。以磁力為動力，讓電解液在試樣兩側噴嘴中連續不斷地噴射出來，用于加快電解作用。
4.離子減薄法
離子減薄法既適用于導電樣品，也適用于非導電樣品(如半導體、陶瓷和巖礦樣品等)的制備，通常用離子減薄器來完成。
5.聚焦離子束
聚焦離子束方法必須在聚焦離子束（FocusedIonBeam,縮寫為FIB）體系中進行。本系統除帶有Ga離子發射裝置之外，還設有與掃描電鏡相似的二次電子信號探測及其成像系統，可在制樣時對Ga離子激發的二次電子進行探測并成像。該體系把Ga離子束匯聚到一個直徑僅為數十nm的區域來轟擊試樣。用轟擊的方法處理試樣，使其變薄。樣品在受到轟擊的過程中，中將著二次電子的生成，二次電子可由系統探測到，形成二次電子像。
6.超薄切片法
切片方法可以用來制備生物試樣薄片，切割相對柔軟無機材料。使用金剛石刀超薄切片前包埋并用玻璃刀整形。對固定試樣包埋劑，可采用丙烯基系列樹脂，也可采用環氧系列樹脂。
這種方法比上述無機材料樣品的超薄切片法復雜，但是可用于觀察生物的精細結構。需要經過取材、固定、漂洗、脫水、浸透、包埋、切片及染色等多個步驟。
7.冷凍制樣法
該方法采用冷凍技術，使得生物樣品快速烘干變硬。
其優點是可避免化學固定劑、脫水劑等對生物組織產生不良影響，降低細胞內物質流失，從而較好地保留生物大分子、酶等結構與活性。它存在著可能被冰晶造成破壞的缺陷。冷凍制樣法有：冷凍固定，冷凍置換，冷凍復型等。
四、樣品防污染措施
透射電鏡觀測過程中樣品污染始終是影響高分辨成像質量最主要的因素之一。造成試樣污染的主要原因是鏡筒中殘余碳氫化合物和吸附于試樣上指示的有機物在電子束輻照某一地區時向它聚集。怎樣進行有效的改進？
（1）改善樣品室的真空衛生。
① 達到盡可能高的真空度，一般使用要優于20μPa;
② 不要用手去接觸放入真空中樣品桿的前端部分，及橡皮圈之前;
③ 樣品桿與大氣接觸時間較長，特別是雨季或者潮濕地區吸附于其上的有機物難以在短期內抽出，從而使置于樣品室內的真空度受到不同程度的損害，條件允許時，宜安裝樣品桿預抽機1臺，不用樣品桿可先在此進行預抽，以保持干燥狀態，而部分樣品桿具有烘烤功能，對污染物揮發較為有利。不信，取下試樣之后最好讓試樣桿重新回到試樣室中，使之處于真空狀態；
④ 對于使用DP作為樣品室預抽的最好不要超過10min，太長油蒸汽多少會污染一些樣品;
⑤ 樣品桿放入后不要馬上將燈絲或電子槍隔離閥打開，因為在插入的過程中多少會人為的造成一點泄漏，即使看著真空度很好，最好再等待1～2min，等真空穩定后再觀察;
⑥ 使用ACD抗污染裝置，每天早上加液氮，既有利于樣品室的真空衛生，又對SIP的壽命是有好處，它的有效時間是7～8h，所以不影響下午工作中午必須補充液氮。記得在工作之前把ACD烤一下；71~3個月應烤鏡筒1次，通常為周末BAKE60h；（2）然后用PLASMACLEANERZ（等離子清洗機）處理試樣。其原理是利用活性等離子在試樣上產生物理轟擊和化學反應的雙重效應，將被洗物體表面有機物和氧化層物質轉化為粒子和氣態物質并經抽真空后排出體外，從而實現清洗。此外，還可用作樣品的預抽機。
（2）BEAMSHOWEＲ是最為經濟有效的防污染方法。
它的原理就是通過強光照射樣品后，可把有機物暫時固定在樣品表明，從而減少了污染率。具體步驟如下:
① LOWMAG模式，是整個銅網與大熒光屏尺寸想接近;
② TEM1-3;
③ CLAP撤出位置;
④ 將光聚成與整個銅網相一致的大小;
⑤ 可以添加ILAP,把光闌孔調到熒光屏外面，只需一個方向旋鈕即可，切記調好方向，便于后調。這個目的就是為了避免熒光屏在強光下時間過長導致老化；
⑥ 沐浴時間為30min;
⑦ 最后將ILAP光闌孔調回并撤出;
⑧ 返回MAG模式;
⑨注意:不是所有的樣品都適合做BEAMSHOWEＲ，只適合耐照的樣品;BEAMSHOWEＲ不是一勞永逸，功效是30min，超過這個時間要再做一次。
對透射電鏡進行觀察，其最終目的就是為了獲得清晰的圖像。拍攝一張優質透射電鏡照片的關鍵是試樣的準備。選用適當制樣方法、適當載網及支持膜并防止試樣受污染。然后通過適當的電鏡操作可迅速拍到質量良好的TEM圖片。
五、基本操作及實例展示
世界上有不同型號和功能的透射電鏡，但是基本的操作流程都是差不多的，如圖一所示。
圖一 透射電鏡拍攝操作基本流程
A.聚光鏡對中：普通透射電鏡的拍攝需插入一級聚光鏡光闌內，電子束剛插入熒光屏時可能并不位于熒光屏中央，見圖二（a）；這時需要先會聚電子束于一點，調節電子束平移至中心，再散開光斑，調節光闌旋鈕使之仍在中心，反復幾次后，電子束與熒光屏能同心收縮，如圖二（b）。
圖二 （a）聚光鏡光闌未對中的情況和（b）聚光鏡光闌對中完成的情況
B.合軸：在電鏡高壓穩定之后，應該進行系統的合軸調整，一般情況下在alpha設為3時，平移電子束和電子槍位置，使spot size1~5的電子束都能會聚在熒光屏中心。
C.選取合適的衍射條件：許多人在對晶體樣品進行攝影時常常忽視了這一步驟，圖三顯示了晶粒內部在不同衍射條件下所表現出的微觀結構變化。按照晶帶定律:hu+kv+lw=0,選擇合適的低指數晶帶軸[uvw]，可以保證衍射束的數目（hkl）足夠多，后續的投影內勢函數計算有足夠的精度。由于透射電鏡衍射襯度還與晶體取向有一定關系，因此在低指數晶帶軸周圍“雙光束條件”下攝影，將讓位錯及其它缺陷更為清楚地暴露出來以供統計與分析。
圖三 軋制純鋁不同取向的晶粒內部微觀結構并不一樣
D.調焦：調整樣品高度，使圖像盡量清晰明銳，可以根據薄膜樣品邊緣出現的菲涅爾條紋（Fresnel fringes）的狀態來調節物鏡焦距旋鈕，如圖四所示。欠焦狀態下，孔洞邊緣外側出現白色菲涅爾條紋（黃色箭頭處），正焦狀態下邊緣光滑無菲涅爾條紋，過焦狀態下菲涅爾條紋位于邊緣內側（黃色箭頭處）。菲涅爾條紋隨欠焦或過焦程度增加而展寬，所以向條紋窄化方向調整可實現正焦。此外，顆粒在試樣表面的襯度也可調整，顆粒在正焦狀態對比度最小，顯得最為光滑。值得注意的一點就是為了獲得質量較好的透射照片常常選擇正焦狀態下欠焦一點來提高對比度，使畫面顯得更加清晰。
圖四 碳膜孔洞邊緣在（a）欠焦（b）正焦（c）過焦狀態下的拍攝圖片
E.物鏡消像散：一般物鏡光闌尺寸和位置的微小變化會引起像散，如果觀察的是磁性材料會干擾物鏡磁場也需要消像散，對一般的材料來說，主要是在拍攝高分辨照片時才會對物鏡像散有嚴格的要求。
低倍時，可見物鏡像散扭曲了菲涅爾條紋，有的在邊緣內測量，有的在外測量，圖五顯示了有物鏡像散與無像散之間的比較。這時，可以先利用前面的方法將圖像調節到欠焦或者過焦，然后調節物鏡像散使菲涅爾條紋恢復均勻對稱，即可消除像散。
圖五 非晶碳膜孔洞在（A）欠焦（B）過焦（C）正焦（D）有物鏡像散的低倍透射照片
高分辨模式下（100K倍甚至更高倍數），則最好需要在非晶區域進行物鏡像散的調節。如圖六所示，是不同條件下的非晶碳膜高分辨照片。需要先調節物鏡光闌的焦距，使圖像盡量清晰，對比度合適，然后進行消像散，使圖一片均勻，在正焦下看起來似乎什么都沒有，但欠焦和過焦圖像應該很清楚，且過焦與欠焦的圖像只有襯度變化，麻點的形狀應一致麻點，沒有方向性。這樣就表明調好了。也可以利用FFT（Fast Fourier Transformation）圖像來輔助調節，當FFT 圖像為橢圓時表明有像散，調節至FFT 圖像為正圓，說明已調好。
通常按麻點對比度及FFT來調整物鏡的像散需大于100K的倍數才能奏效，因此推薦目前按菲涅爾條紋進行低倍調整的方法，再逐漸增加倍數以確保物鏡的像散不越調越大。萬一實在是一不小心調的越偏點，就覺得越調越不好回不了頭，那又該如何是好呢？別擔心，你可以單擊NTRL（復位）鍵，使其恢復初始狀態，同時調整物鏡像散模式。
圖六 碳膜非晶區在（A）無像散無漂移（B）有像散（C）嚴重像散（D）無像散有一點漂移（E）無像散有更大的漂移（F）無像散無漂移情況下的高分辨照片和對應的FFT花樣
通常情況下，通過上述逐步調整，可平穩地拍攝出低倍至高倍各類透射照片。其余則是在拍照軟件中調整對比度與曝光時間來獲得相對優質的照片。另一個小提示是保存照片時最好存成2種格式，一種是拍照軟件專用格式，另一種是TIFF。選用軟件專用格式，就是要將照片的完整資料全部保存起來，以便以后再查；TIFF與其他BMP格式、JPEG格式和PNG格式相比，儲存了更多細微層次上的圖像信息，圖像質量很高，因此對原稿復制很有幫助。
六、 高分辨拍攝要點
高分辨電子顯微像就是使物鏡后焦面投射束河的幾個衍射經過物鏡光闌后，因其相位相干所產生相位襯度的顯微像。因參與成像的衍射束個數不一樣而獲得了不一樣名字的高分辨像。圖七所示固溶態Al-Si合金二維晶格像是用透射束和二維方向衍射束來表現。
圖七 固溶態Al-Si合金的二維晶格像
高分辨電子顯微像的拍攝是一項十分細致費時的工作，需要注意很多問題，比如：
（A）拍攝含非晶結構薄膜的高分辨像時，要關注像中晶區與非晶區之間的細節，尤其是界面；含納米晶及非晶區納米晶樣品拍高分辨像要方便得多。當晶區與非晶區之間的界限細節被遮蔽時，表明加速電壓與透射電流的穩定性或工作環境的穩定性出現了問題。另外非晶膜傅里葉變換花樣及衍射花樣質量也可用于判斷非穩定波數區間。
（B）高分辨像的質量和拍攝時的聚焦漂移與試樣漂移關系極大。聚焦漂移是指聚焦隨著時間推移會向著欠焦或者過焦的一側移動的現象，如圖七中（D）（E）所示。
（C）樣品漂移通常發生在樣品剛插入樣品臺內的一瞬間，還有剛加入液氮時也有影響，所以需要確定以上2種操作后讓樣品到達穩定狀態所需的時間。這段時間有時長達2~3min。
（D）確認物鏡球差系數。一般可以依據廠家提供的數據，正確操作，選定最佳聚焦量，從而達到最佳的分辨率水平。
七、小結：
拍攝一張優質透射電鏡照片的關鍵是試樣的準備。選用適當制樣方法、適當載網及支持膜并防止試樣受污染。然后通過適當的電鏡操作可迅速拍到質量良好的TEM圖片。
