角膜新生血管（CoNV）的特征是角膜組織中血管的異常生長，是世界范圍內造成視力損害的主要原因。目前，可用的治療方案療效有限，并與生物障礙和清除機制導致的不良反應相關。為了解決這一挑戰，湖南大學史俊峰教授和中南大學湘雅二院眼科李蕓主任合作開發了一種新的局部傳遞系統——Gel 2_1&Eylea——一種由細胞穿透肽1介導的游離滴眼液水凝膠。Gel 2_1&Eylea具有優越的膜通透性，增加穩定性，延長藥物在眼表的保留時間，從而提高藥物療效。在兔CoNV模型中，Gel 2_1&Eylea顯著降低新生血管密度，對正常角膜鞏膜角膜緣血管無不良影響，具有良好的療效和生物相容性。本研究確定了一種很有前景的治療CoNV的方法，也可能有利于其他眼部新生血管疾病。
相關研究內容以“Aflibercept Loaded Eye-Drop Hydrogel Mediated with Cell-Penetrating Peptide for Corneal Neovascularization Treatment”為題于2023年9月7日發表在《Small》上。
圖1 Gel 2_1&Eylea治療角膜新生血管的應用
本研究設計一種新型的細胞穿透肽1，它可以中和帶負電荷的Eylea并穿透角膜基質（1&Eylea）。使用水凝膠可以增加1&Eylea的保留時間和攝取效率。因此開發了一種新型的細胞穿透肽（稱為Gel 2_1）介導的Gel2_1&Eylea來治療角膜新生血管。體外和體內實驗表明，與單獨使用Eylea相比，滴眼液Gel2_1&Eylea具有較高的相容性，對抗血管生成的治療效果更優越（圖1）。
圖2 1&Eylea的制備和表征
摩爾比為1：1的1&Eylea配合物帶負電荷，而摩爾比為1：10的1&Eylea配合物則帶正電荷，表明10等量的帶正電荷的1可以通過靜電相互作用中和帶負電荷的Eylea。從圖2B中可以看出，1和Eylea形成聚集體，而改變1的濃度并沒有導致明顯的形態變化。熒光素標記的多肽1在孵育1h后可以進入人角膜上皮細胞-7（HCE-T）細胞的細胞質（圖2C）。
圖3 滴眼液水凝膠的生物物理表征
在材料配方過程中加入Eylea，能夠精確地控制封裝藥物的濃度，藥物-肽復合物形成一個不透明的水凝膠（圖3A），表明在水凝膠基質中存在較大的聚集體。透射電鏡圖像顯示，水凝膠基質由納米纖維組成，也觀察到納米顆粒（圖3A），表明1&Eylea復合物的封裝并沒有顯著改變Gel2_1&Eylea的形態。所有組在216 nm處觀察到一個負峰，表明1&Eylea復合物封裝后形成穩定的β-sheet結構（圖3B）。為了評估1&Eylea對Gel 2_1&Eylea的流變特性影響，監測了存儲模量（G'）隨時間的函數，發現剪切恢復性能非常接近Gel2（圖3C）。38%的Eylea在4h內從Gel 2_1&Eylea（1：10）中釋放出來，而大約31%的水凝膠從1：1的比例釋放出來（圖3D）。如圖3E、F所示，絕大多數HCE-T細胞顯示鈣黃綠素AM（活細胞）染色陽性，而在所有水凝膠組中只觀察到少數碘化丙啶（PI，死細胞）染色的細胞。這些結果表明，該水凝膠是無毒的，使其成為開發生物相容性眼液基質的一個有前途的候選藥物。
圖4 Gel2_1&Eylea的體內療效評價
術后5天觀察到角膜間質內新血管明顯充血（圖4A），治療前各組間CoNV面積無差異（圖4C），證實CoNV模型的成功建立。不同配方處理后的CoNV面積占角膜總面積的百分比（圖4D）與CoNV面積呈相同的趨勢。綜上所述，用細胞穿透肽1介導的Eylea水凝膠滴眼液水凝膠具有良好的CoNV抑制能力。
圖5 Gel 2_1&Eylea選擇性抑制病理性新血管
治療14天后，使用前段光學相干斷層掃描血管造影（AS-OCTA）獲得血管圖像（圖5A），并使用Image J軟件生成二值化和骨骼化圖像。與Eylea組和NS組相比，Gel 2_1&Eylea組CoNV的血管面積密度（VAD）值顯著降低（圖5B），表明Gel 2_1&Eylea在降低新血管密度方面非常有效。CoNV的容器直徑指數（VDI）值在三組間沒有顯著差異（圖5C），表明Gel 2_1&Eylea對血管形態沒有顯著影響，是安全的。三組患者角膜緣的VAD和VDI值均無明顯變化（圖5D、E）。在角膜上觀察到一個較大的熒光素斑點，這是由CoNV模型發展過程中出現的縫合線引起的（圖5F 白色箭頭）。NS組、Eylea組和Gel 2_1&Eylea組的染色評分差異無統計學意義（圖5G）。結合圖5D、E、G中的數據，這些結果表明，Gel 2_1&Eylea具有較高的生物相容性。
雖然抗VEGF藥物被認為是治療眼部新生血管疾病最有效的治療方法，但由于存在多種屏障和清除機制，傳統的局部滴眼液的療效有限。為了解決這一挑戰，本研究開發了一種含有細胞穿透肽1的新型滴眼液水凝膠。由此得到的Gel 2_1&Eylea具有剪切誘導的變薄特性，可以用作滴眼液。封裝的1&Eylea復合物可以迅速從水凝膠基質中釋放出來，而細胞穿透肽的存在促進Eylea的滲透。水凝膠的使用可以延長藥物的停留時間，從而加強對病理區域的滲透。體內外實驗表明，Gel 2_1&Eylea可以抑制新的異常血管發育，而對正常血管的影響很小。總之，本研究表明2_1&Eylea凝膠可以作為Eylea治療角膜新生血管的一種有效和安全的遞送系統。
文章來源：https://doi.org/10.1002/smll.202302765
