近期，西南交通大學翁杰、譚歡和南京兒童醫院鄭朋飛研究員在科愛創辦的期刊Bioactive Materials上聯合發表研究性文章：3D打印具有抗菌潛力的三元素摻雜羥基磷灰石/聚己內酯復合支架用于骨肉瘤治療和骨再生。體外研究表明Se、Sr和Zn摻雜羥基磷灰石（Se/Sr/Zn-HA）具有良好的生物相容性、抗菌性、抗腫瘤和促成骨功能，其與聚己內酯混合制備的復合支架（Se/Sr/Zn-HA-PCLs）表現出良好的保真度和力學性能。體內研究證實Se/Sr/Zn-HA具有優異的抗腫瘤效果，Se/Sr/Zn-HA-PCLs能有效促進骨缺損修復。
1、研究內容簡介
骨肉瘤是一種常見的惡性骨腫瘤，主要發生于兒童和青少年，已成為引起青少年癌癥死亡的第二大原因。目前，骨肉瘤的主要治療方法包括手術切除、化療和放療，而骨肉瘤引起的骨缺損常通過自體骨移植修復，但手術切除不能完全消除病灶部位殘留的骨腫瘤細胞，殘留腫瘤細胞可增殖轉移，增加腫瘤復發風險。此外，骨肉瘤對放療無反應，且有很高的化療耐藥傾向。自體骨移植治療骨肉瘤切除術引起的骨缺損是一種替代方法，但存在供體部位并發癥、免疫排斥反應和供應有限等多個問題，限制了其臨床應用。因此，開發具有修復骨肉瘤引起的骨缺損，又能消除癌細胞并抑制細菌感染的人工骨替代物成為臨床亟待解決的問題。羥基磷灰石（HA）是人體硬組織的主要無機成分，因其優異的生物相容性、骨傳導性和生物活性而廣泛用于骨組織工程。不同的微量元素在骨組織的生長發育中發揮不同的作用。例如，鋅（Zn）、錳（Mn）和鍶（Sr）具有良好的成骨作用；鎂（Mg），銅（Cu）以及鈷（Co）具有出色的血管生成作用；硅（Si）和硼（B）具有成骨和血管生成作用；硒（Se）可以促進骨組織發育、抗腫瘤和抗衰老。然而，單元素摻雜HA很難修復由骨肉瘤引起的骨缺損，而多元素摻雜HA具備的復合功能使其在修復骨肉瘤引起的骨缺損中具有潛力。據悉，使用三元素摻雜HA治療骨肉瘤，修復骨缺損和術后抗感染的研究較少。因此，本研究旨在設計并制造一種多功能支架，在消除腫瘤的同時修復骨缺損，并預防骨肉瘤的術后感染。如圖1所示，將水熱法合成的Se、Sr和Zn共摻雜HA（Se/Sr/Zn-HA）和聚己內酯（PCL）混合并通過3D打印技術制備Se/Sr/Zn-HA-PCLs復合支架，并驗證Se/Sr/Zn-HA的抗菌潛力和評估Se/Sr/Zn-HA的體外和體內抗腫瘤特性，以及促成骨分化潛力。最后在大鼠股骨缺損模型驗證了Se/Sr/Zn-HA-PCLs的骨缺損修復功能。
圖 1. 用于腫瘤治療、骨缺損修復和抗菌的Se/Sr/Zn-HA和Se/Sr/Zn-HA-PCLs的制備和功能示意圖。
一、HA和元素摻雜HA的制備和表征
本研究采用水熱法合成HA和元素摻雜HA，其優點是反應溫度低，產物結晶度好，產品形貌易于控制，為獲得亞微米甚至納米級或納米結構材料提供了可能性。SEM結果表明，純HA呈帶狀晶體形狀（圖2 A），長度為2–10 μm，寬度為1 μm，Se-HA促進片狀的聚集，而長度縮短至2–5 μm，寬度有所增加。與Se-HA相比，Sr-HA表現出更規則的放射花瓣狀結構，其平均寬度約為5 μm，并且有少數不完整微球結構，表明Sr-HA隨著摻雜量增加從放射花瓣狀結構轉變為球狀結構。Zn-HA的顆粒形態相對均勻，由薄片聚集形成直徑約7-9μm的規整微球結構。Se/Sr-HA是一種球狀連接結構，由薄片聚集組成，球狀結構為徑向，與Sr-HA的結構相似。Se/Zn-HA是薄片聚集而成的球形結構，且薄片相對稀疏，球形度不如Zn-HA，直徑為15–25 μm。Sr/Zn-HA呈規則球形結構，為稀疏和徑向片狀，部分Sr/Zn-HA的薄片密度大于Zn-HA，直徑為20–30 μm。Se/Sr/Zn-HA由放射狀花瓣狀和微球組成，微球直徑范圍為2-10 μm，徑向花瓣狀結構與Sr-HA結構相似，微球狀結構與Zn-HA結構一致。三元素摻雜的Se/Sr/Zn-HA的形貌與Se-HA、Sr-HA或Zn-HA的組合形貌相似。采用XRD分析樣品物相，結果表明，元素摻雜 HA的衍射峰與HA標準圖（JCPDS09-0432）相似，元素摻雜的HA樣品保持HA的主相（圖2B）。采用FTIR分析摻雜HA的化學結構（圖2C），在所有樣品的FTIR光譜中均顯示了HA的官能團吸收峰。EDS（圖2D）結果表明，Zn、Sr和Se在Se/Sr/Zn-HA表面均勻分布，表明Se/Sr/Zn-HA的成功制備。
圖 2. HA、Se-HA、Sr-HA、Zn-HA、Se/Sr-HA、Se/Zn-HA、Sr/Zn-HA 和 Se/Sr/Zn-HA 的表征。（A）SEM圖像，（B）XRD圖譜，（C）FTIR光譜和（D）Se/Sr/Zn-HA的元素分布。
二、HA和元素摻雜HA的抗菌性評價
將HA、Se-HA、Sr-HA、Zn-HA和Se/Sr/Zn-HA浸提液和金黃色葡萄球菌和大腸桿菌共培養后進行定量分析，細菌的活性如圖3A和圖3B所示。HA和Se-HA抗菌效果略優于對照組，Sr-HA和Zn-HA組比Se-HA和對照組的抗菌效果更好，尤其是Zn-HA，這與Zn2+優異的抗菌功能有關。雖然Sr-HA、Zn-HA和Se/Sr/Zn-HA的抗菌效果與對照組有顯著差異，但Se/Sr/Zn-HA浸提液與大腸桿菌或金黃色葡萄球菌共培養后均表現出最佳的抗菌效果，表明SeO32−、Sr2+和Zn2+的協同給藥獲得最佳的抗菌效果。將樣品浸提液和細菌懸液涂覆到固體培養基上，觀察菌落生長。雖然Se/Sr/Zn-HA的金黃色葡萄球菌菌落密度高于大腸桿菌，但Se/Sr/Zn-HA仍表現出優越的抗菌效果，表明SeO32−、Sr2+和Zn2+聯合給藥可獲得最佳的抗菌效果。綜上所述，Se/Sr/Zn-HA對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌均具有最佳的抗菌效果，證實了SeO32−、Sr2+和Zn2+協同給藥的抗菌優勢。
圖 3. HA，Se-HA，Sr-HA，Zn-HA和Se/Sr/Zn-HA浸提液與細菌共培養24小時的抗菌性能評價。（A）浸提液與大腸桿菌共培養后的OD值；（B）浸提液與金黃色葡萄球菌共培養后的OD值；（C）大腸桿菌和浸提液共涂板；（D）金黃色葡萄球菌和浸提液共涂板。
三、HA和元素摻雜HA的體外成骨分化評價
通過檢測樣品浸提液和大鼠骨髓間充質干細胞（BMSCs）共培養后的ALP活性和茜素紅染色來評估樣品促成骨分化能力。培養7天后，元素摻雜HA組的ALP活性與對照組相比無明顯差異（圖4A），但BMSC表現出分化成骨細胞的趨勢。培養14 天后，HA的ALP活性強于對照組，并觀察到成骨分化，而Se/Sr/Zn-HA培養的BMSCs ALP水平顯著高于對照組。Zn-HA對ALP活性的影響最小，培養7天和14天后ALP水平均略高于對照組。Se/Sr/Zn-HA含有上述離子，具有良好的促骨分化潛力。
茜素紅染色結果與ALP結果相似，但Zn-HA比對照組、HA和Se-HA可促進更多的鈣質沉積，如圖4B所示。與對照組相比，材料組均有明顯的鈣質沉積。此外，隨著元素類型的增加，鈣質沉積的效果變得更明顯。由此可見，SeO32−、Sr2+和Zn2+均可促進BMSCs的成骨分化，三者的協同給藥可達到最佳的成骨分化效果。免疫熒光染色顯示BMSCs呈多角星形擴散而無分化（圖4C），表明BMSCs培養7天后形態沒有發生變化；而與Se/Sr/Zn-HA共培養的BMSCs形態卻發生顯著變化，細胞長寬比增加，細胞假足延伸形成拉伸結構，表明SeO32−、Sr2+和Zn2+協同給藥能促進BMSCs的鋪展。
圖 4. HA，Se-HA，Sr-HA，Zn-HA和Se/Sr/Zn-HA的體外成骨分化潛力評價。（A）BMSC在用HA，Se-HA，Sr-HA，Zn-HA和Se/Sr/Zn-HA培養7天和14天后ALP的分泌水平；（B）用HA，Se-HA，Sr-HA，Zn-HA，Se/Sr-HA，Se/Zn-HA，Sr/Zn-HA和Se/Sr/Zn-HA的α-MEM培養BMSCs 21天后的ARS染色；（C）用Se/Sr/Zn-HA的α-MEM培養BMSC7天后的羅丹明標記鬼筆環肽和DAPI免疫熒光染色。
四、HA和元素摻雜HA的體外抗腫瘤評價
將HA和元素摻雜HA浸提液與人骨肉瘤細胞（143b）共培養來評價材料的體外抗腫瘤能力。結果顯示，含有SeO32−浸提液的143b數量最少，且與其他組存在顯著差異，表明SeO32−具有更好的抗腫瘤作用，如圖5A所示。培養1 天后，Zn-HA的143b數量高于Sr-HA和對照組；培養3 天后，材料組143b數量均低于對照組；培養5天后，Zn-HA的143b數量低于Sr-HA，表明Zn2+發揮抗腫瘤作用的時間較長。培養5 天后，除Sr/Zn-HA外，雙元素摻雜HA的143b數量均低于單元素摻雜HA組和對照組，這與Sr2+抗腫瘤效果較差有關。雖然Sr2+抗腫瘤效果較差，但仍高于HA組和對照組。然而，在培養期間，Se/Sr/Zn-HA的143b數量均明顯低于對照組和不含SeO32-組，表明Se/Sr/Zn-HA具有顯著且持久的抗腫瘤作用。Tunel 染色結果表明，143b與 Se-HA 和 Se/Sr/Zn-HA 共培養3天后的存活率最低，如圖 5B 所示。此外，含SeO32−浸提液均具有優異的抗腫瘤效果，而對照組、HA和Sr-HA幾乎沒有觀察到143b凋亡，Se/Sr/Zn-HA中143b凋亡最多，這表明了Sr2+和Zn2+摻入進一步強化了SeO32−的抗腫瘤效果， SeO32−、Sr2+和Zn2+三者的協同給藥能達到最佳的抗腫瘤能力。
圖 5. HA，Se-HA，Sr-HA，Zn-HA，Se/Sr-HA，Se/Zn-HA，Sr/Zn-HA和Se/Sr/Zn-HA浸提液與143b共培養評價體外抗腫瘤潛力。（A）1 天、3 天和5天的OD值；（B）第3天的Tunell染色。
五、HA和元素摻雜HA的體內抗腫瘤評價
將各類HA分別與PBS混合后注射到荷瘤小鼠的腫瘤部位，結果如圖6（A）和（B）所示。結果表明，注射PBS的小鼠腫瘤顯著增大，而HA處理的小鼠腫瘤沒有顯著抑制，但仍略小于PBS處理的小鼠腫瘤。Sr-HA、Zn-HA和Sr/Zn-HA的抗腫瘤效果與HA相似，表明Sr2+和Zn2+的抗腫瘤效果較差。Se-HA、Se/Sr-HA、Se/Zn-HA和Se/Sr/Zn-HA的腫瘤顯著小于其他組，表明SeO32−具有比Sr2+ 和Zn2+更好的抗腫瘤效果。Se/Sr-HA和Se/Zn-HA的抗腫瘤效果與Se-HA相當，表明Sr2+和Zn2+的摻入并沒有削弱SeO32−的抗腫瘤效果，這與體外抗腫瘤結果一致。然而，Se/Sr/Zn-HA處理的小鼠的腫瘤最小。采用H&E（圖6C）和Ki67染色（圖6D）分析腫瘤組織內腫瘤細胞凋亡，結果顯示對照組腫瘤細胞未發生明顯凋亡，HA、Sr-HA、Zn-HA和Sr/Zn-HA的結果相似，表現出微小的抗腫瘤作用。而Se-HA、Se/Sr-HA、Se/Zn-HA和Se/Sr/Zn-HA給藥后出現明顯的腫瘤細胞凋亡，其抗腫瘤效果優于對照組、HA、Sr-HA、Zn-HA和Sr/Zn-HA，這與體外結果一致。因此，SeO32−具有優異的抗腫瘤效果，而SeO32−、Sr2+和Zn2+的協同給藥增強了抗腫瘤效果。
圖6. HA，Se-HA，Sr-HA，Zn-HA，Se/Sr-HA，Se/Zn-HA，Sr/Zn-HA和Se/Sr/Zn-HA體內抗腫瘤潛力評價。（A）處死小鼠后提取腫瘤；（B）樣品注射后相對腫瘤體積隨時間變化；（C）第8天腫瘤組織的H&E染色，比例尺：100μm；（D）第8天腫瘤組織的Ki67染色，比例尺：100μm。
六、HA-PCLs、Se-HA-PCLs、Sr-HA-PCLs、Zn-HA-PCLs 和 Se/Sr/Zn-HA-PCLs 支架的構建及體內成骨評價
本研究進一步采用PCL和HA的混合生物墨水結合3D打印技術構建多孔支架，相應支架的形貌如圖7A所示。所有復合支架均表現出均勻且相互穿透的三維多孔結構，大孔尺寸約為350 μm。Sr-HA-PCLs和Se/Sr/Zn-HA-PCLs的表面較粗糙，其他組表面光滑，這與Sr-HA和Se/Sr/Zn-HA的結構有關。Se/Sr/Zn-HA-PCLs的橫截面元素分布如圖7B所示，橫截面顯示出直徑約為400 μm的規則圓形輪廓，Se、Sr和Zn在支架內均勻分布，表明Se/Sr/Zn-HA和PCL均勻混合。
通過修復SD大鼠股骨缺損來評估支架的促成骨能力，結果如圖7C所示。H&E染色表明，3D打印支架的成骨作用優于對照組。Se-HA-PCL、Sr-HA-PCLs和Zn-HA-PCLs的成骨作用優于HA-PCLs。Sr-HA-PCLs和Zn-HA-PCLs的成骨作用相似，Sr-HA-PCLs與對照組相似。Masson染色與H&E染色結果相似：HA-PCLs優于對照組，而Se-HA-PCLs，Sr-HA-PCLs和Zn-HA-PCLs優于HA-PCLs，Se/Sr/Zn-HA-PCLs的修復效果最佳。上述結果表明，SeO32−、Sr2+或Zn2+可以改善HA的成骨效果，且Se/Sr/Zn-HA-PCLs的效果優于Se-HA-PCLs，Sr-HA-PCLs和Zn-HA-PCLs，這與 ALP活性和茜素紅染色結果相似。在這項研究中，SeO32−、Sr2+和Zn2+協同改善了HA的生物活性，表現出比HA或單元素摻雜HA更好的促骨、抗腫瘤和抗菌效果，從而顯著提高骨修復效果，降低腫瘤復發的風險。
圖 7. HA-PCLs、Se-HA-PCLs、Sr-HA-PCLs、Zn-HA-PCLs 和 Se/Sr/Zn-HA-PCLs 的表征。（A）SEM圖像；（B） Se/Sr/Zn-HA-PCLs橫截面元素分布。(C) 復合支架植入大鼠股骨4周和12周后的H&E和Masson染色;S代表支架，NB代表新骨;比例尺：1000 μm，放大區域比例尺：100 μm。
2、原文信息
Hao Huang, Lei Qiang,Minjie Fan, Yihao Liu, Anchun Yang, Dongbiao Chang, Jinsheng Li, Tong Sun,Yiwei Wang, Ruoyi Guo, Hanjie Zhuang, Xiangyu Li, Tailin Guo, Jinwu Wang, HuanTan***, Pengfei Zheng**, Jie Weng*.
3D-printed tri-element-doped hydroxyapatite/polycaprolactone composite scaffolds with antibacterial potential forosteosarcoma therapy and bone regeneration.
BioactiveMaterials, 31 (2024) 18-37.
DOI: 10.1016/j.bioactmat.2023.07.004.
