亞硝胺雜質已成為懸在藥監部門與生產商頭頂的達摩克利斯之劍，威脅著上市藥品的質量與患者的用藥安全。雖然亞硝胺雜質（Nitrosamines）也有可能是基因毒性雜質（Genotoxic Impurities），但基因毒性雜質和亞硝胺雜質是單獨的兩個評估模塊，他們有各自細分的法規要求，亞硝胺雜質的控制更嚴格。
亞硝胺雜質還是要研發人員基于風險評估（評估幾大要素包括工藝本身、回收溶劑、物料，包材，水等）、ICH限度計算以及三批檢測結果來最終制定控制策略，具體如下所述：
一、 雜質限度制定
1、 僅有一種（亞硝胺）雜質：按照限度（AI/MDD）進行質量控制
①一般亞硝胺雜質/非NDSRIs：
▲表1-主流國家官方亞硝胺限度要求
②原料藥亞硝胺相關雜質NDSRIs：
對于NDSRIs，FDA推薦了一種根據預測的致癌效力分類分配推薦限度的方法，如下表所示：
▲表2-NDSRIs物種預測致癌效力分類和相關AI限度
關于上表中NDSRIs預測致癌效力分類方法和相關AI推薦限度確認流程如下圖所示：
注：上述決策樹中α-C及下文β-C含義如下圖：
▲圖1-NDSRIs致癌效力分類預測和確認推薦限度流程圖
上圖中致癌效力評分由如下3個部分組成：α-氫評分（表3）+失活特征評分（所有出現的結構特征得分之和） （表4）+激活特征評分（所有出現的結構特征得分之和） （表5）。
▲表3-每個α-碳上的氫原子計數和相應的α-H得分情況
注：當亞甲基α-碳不是乙基的一部分時，得3分。當亞甲基α-碳是乙基的一部分，得2分。
▲表4-失活特征及相關評分列表
注：*不包括N-亞硝基位于吡咯烷環、至少含有一個硫原子的六元環或嗎啉環（全部分開計算）中的例子。
**不包括羧酸和芳基（單獨計算），以及酮（數據沖突）。其它的吸電子基團示例僅限于Cross KP和Ponting DJ, 2021, Developing Structure-Activity Relationships for N-Nitrosamine Activity, Comput Toxicol, 20:100186中描述的那些，文獻中它們被稱為“β-碳吸電子基團”。
***β-碳必須處于sp3雜化狀態，這一規則才適用。
▲表5-激活特征和相關分數列表
舉例說明：
案例1 N -亞硝基-l-奈比洛爾
效力得分=1+2+1=4，效力分類4級對應的AI推薦限度為1500ng/天。
案例2 N -亞硝基-氯胺酮
▲圖2-N-亞硝基-氯胺酮致癌效力分類確認思路
其它FDA公布的NDSRIs推薦AI限度詳見附件1（如需要附件，可轉發文章，憑借截圖聯系注冊圈管理員獲取）。
2 、多于一種（亞硝胺）雜質
EMA：根據決策樹兩種控制方式（①所有檢出的N-亞硝胺的總日攝入量不超過所檢出的限度最低的N-亞硝胺的AI值；②各亞硝胺雜質實際檢出值與其限度比值的總和不大于100%）；
FDA：如果發現不止一種亞硝胺雜質（NDSRIs和/或小分子亞硝胺），且亞硝胺的總水平超過了基于最大日劑量的藥品中最強效亞硝胺（限度最低的AI），則持有人應聯系FDA當局。如果個別亞硝胺的推薦AI限度差異很大，FDA鼓勵持有人提出一個不同于推薦的檢測到的最有效的亞硝胺雜質AI的亞硝胺限度，并與FDA當局聯系確認。
二、控制策略
FDA：原控制策略超過LOQ（0.03或0.02根據MDD）ppm需要報告；
法規來源：2021-02，Control of Nitrosamine Impurities in Human Drugs （Guidance for Industry）：
The LOQ may be considered the reporting threshold for nitrosamine impurities （i.e., the limit above which an impurity should be reported in the certificate of analysis）.
2023年8月更新后：NDSRIs限度根據已有毒理學數據已經放寬，但暫未明確更多配套控制策略。
法規來源：2023-08，Recommended Acceptable Intake Limits for Nitrosamine Drug Substance- Related Impurities （NDSRIs） Guidance for Industry
EMA：方法靈敏度做到限度的30%以下，并三批商業批數據未檢出，API中定期檢測；方法LOQ做到限度的10%以下，并三批商業批數據未檢出，則可以免檢。
法規來源：
Questions and answers for marketing authorisation holders/applicants on the CHMP Opinion for the Article 5（3）of Regulation （EC）No 726/2004 referral on nitrosamine impurities in human medicinal products ：
If quantitative testing is performed as a routine control, the LoQ should be s of the acceptable limit based on the relevant acceptable intake （AI）for the respective nitrosamine impurity;
If quantitative testing is performed to justify skip testing, the LoQ of the analytical procedure employed should be s 30%of the acceptable limit based on the AI.
三、亞硝胺雜質研究決策樹
▲圖3-亞硝胺雜質研究決策樹
對于亞硝胺雜質的研究需要我們遵循質量源于設計的理念，在項目開發過程中就充分將其考慮在內，比如：在工藝路線開發的時候，應盡可能減少或避免可能引入可能攜帶亞硝基試劑的溶試劑的使用，并對其制定嚴格的控制策略，包括供應商審計、質量保證協議、工藝路線清除設計等，都應該進行全面深入的設計。樣品的檢測在工藝路線確定以后，就應該完成相關分析方法的開發，對其制備樣品進行檢測和多批次數據收集，為未來限度制定提供充分的依據。
各國藥監機構對于亞硝胺雜質的關注度日趨重視，國內外對于亞硝胺雜質的法規也日趨完善，尤其是原料藥相關的亞硝胺雜質（NDSRIs）。NDSRI亞硝胺雜質通常沒有明確確定的允許攝入量AI，為此FDA和EMA給NDSRI設定了苛刻的AI值。如FDA指定的臨時AI為26.5ng/天；EMA為新的NDSRI設定了18ng/天的臨時AI。隨后EMA引入了178ng/天的臨時AI，直到數據可以證明其確切的AI。這種臨時AI的使用時間為1年過渡期。這種限度設定缺乏合理性，給藥企帶來了很大的挑戰難度。
2023年7月底8月初，EMA及FDA先后發布了更加合理化的亞硝胺的控制策略，FDA在官方發布了基于上述控制策略一系列NDSRIs的臨時AI限度。相對于上一版的總雜0.03ppm的控制要求，已經有了很大的改善。關于質量控制策略，企業也有了更多的發言權和參與機會。隨著國內外研究的不斷深入，毒理數據的日趨完善，將來有望改善亞硝胺風險評估、限度、研究控制策略及各國藥監機構監管的日趨明朗和合理化。
參考文獻
1. Questions and answers for marketing authorization holders/applicants on the CHMP Opinion for the Article 5（3） of Regulation （EC） No 726/2004 referral on nitrosamine impurities in human medicinal products，EMA/409815/2020 Rev.17；
2. Control of Nitrosamine Impurities in Human Drugs Guidance for Industry，FDA，February 2021，Pharmaceutical Quality/ Manufacturing Standards/ Current Good Manufacturing Practice （cGMP，Revision 1）.
3. Nitrosamine impurities in medicines -Information for sponsors and manufacturers, TGA，20 July 2022.
4. WHO Information Note ：UPDATE ON NITROSAMINE IMPURITIES，WHO，20 November 2019.
5. ICH. M7（R1） Assessment and control of DNA reactive （mutagenic） impurities in pharmaceuticals of limit potential carcinogenic risk [EB/OL］.（2017-03-31）。
6. Workflows for Quality risk management of nitrosamine risks in medicines ,EPIFA，Version 2.0 ，Aug 2022.
7. Recommended Acceptable Intake Limits for Nitrosamine Drug Substance- Related Impurities （NDSRIs） Guidance for Industry，FDA, 04 August，2023.
8. Questions and answers for marketing authorisation holders/applicants on the CHMP Opinion for the Article 5（3）of Regulation （EC）No 726/2004 referral on nitrosamine impurities in human medicinal products，EMA，28 July，2023.
