生物制藥市場正在迅速增長，預(yù)計在2018年至2024年之間，復(fù)合年增長率為8.6％，到2024年將達(dá)到3,900億美元。單克隆抗體（mAB）是市場上的主要蛋白質(zhì)類型藥物，占總市場的四分之一。單克隆抗體領(lǐng)域始于30年前，批準(zhǔn)了用于預(yù)防腎臟移植排斥反應(yīng)的Orthoclone OKT3，此后，每年都有三到五種基于單抗的新產(chǎn)品獲批。目前，藥品市場以生產(chǎn)生物仿制藥為導(dǎo)向，預(yù)計蛋白質(zhì)藥物的數(shù)量將進(jìn)一步增長。生物大分子分子量大且不穩(wěn)定，通常采用腸胃外給藥。蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性是生物制藥設(shè)計和開發(fā)的主要出發(fā)點(diǎn)。凍干是制造穩(wěn)定的生物制藥產(chǎn)品的首選方法，目前50%的生物藥采用凍干制劑從而保證其使用穩(wěn)定性。由于生物藥的復(fù)雜性和敏感性，通常加入藥物特異性輔料來優(yōu)化凍干過程，以使其生物活性成分穩(wěn)定。例如，皮下注射治療性蛋白藥物由于粘度高導(dǎo)致可注射性降低和復(fù)溶時間增長，需要加入降粘劑，以降低溶液粘度。
一、生物制劑處方穩(wěn)定性
溶液中的蛋白質(zhì)通常不穩(wěn)定，凍干是實(shí)現(xiàn)穩(wěn)定生物制藥配方的主要方法，但受凍干條件影響，蛋白質(zhì)分子可能會不穩(wěn)定。化學(xué)不穩(wěn)定性會導(dǎo)致肽共價鍵的形成或破壞，從而產(chǎn)生新的化學(xué)體。常見的過程包括氧化、脫酰胺和異構(gòu)化。脫酰胺容易發(fā)生在中性和堿性pH值下，堿性條件下的脫酰胺比例是酸性條件下的三倍。異構(gòu)化通常發(fā)生在中性或酸性條件下，可能導(dǎo)致蛋白分子的親和力降低。物理不穩(wěn)定會導(dǎo)致蛋白質(zhì)變性和聚集，影響物理穩(wěn)定性的因素包括 pH 值、溫度、離子強(qiáng)度、凍融、蛋白質(zhì)濃度和機(jī)械應(yīng)力。糖、聚合物、表面活性劑、多元醇和氨基酸等輔料對于在凍干和儲存期間穩(wěn)定生物蛋白制劑至關(guān)重要，但由于腸外制劑的監(jiān)管要求，其選擇十分有限。
二、凍干過程
凍干是在冷凍后通過升華從生物制藥藥物中去除水分的過程，這種技術(shù)的時間和經(jīng)濟(jì)成本通常較高。凍干過程包括冷凍、初級和次級干燥步驟。
冷凍步驟旨在將大部分水變成冰，形成凍結(jié)濃縮溶液。冷凍期間的溫度必須設(shè)置在最大凍結(jié)濃度溶液的玻璃化轉(zhuǎn)變溫度和結(jié)晶材料的共晶溫度以下。退火是冷凍后執(zhí)行的一步，可形成更大、更均勻的冰晶并使填充劑結(jié)晶，從而提高初級干燥的效率。冷凍過程中蛋白質(zhì)分子所在的體系特性會發(fā)生變化，影響產(chǎn)品的穩(wěn)定性。冷卻速度會影響冰晶的大小和形態(tài)，進(jìn)而影響凍干的干燥階段。蛋白質(zhì)濃度、類型和退火步驟的加入也會影響產(chǎn)品復(fù)溶時間。
初級干燥通過升華去除冷凍的游離水，適當(dāng)選擇板層溫度和壓力值可以縮短該過程。初級干燥是凍干過程中最耗時和能量的階段，通常最佳壓力為0.1-0.2 mbar，板層溫度選擇基于玻璃化轉(zhuǎn)變溫度Tg'和塌陷溫度Tc。通常將產(chǎn)品溫度保持在Tg'以下2-3°C以保持蛋白質(zhì)穩(wěn)定性，但是適當(dāng)?shù)奶幏絻?yōu)化甚至允許產(chǎn)品在Tg'或Tc以上進(jìn)行干燥。當(dāng)產(chǎn)品溫度Tp等于板層溫度時，初級干燥即完成。通常Tg'和Tc可以分別通過差示掃描量熱法和凍干顯微鏡來確定。
二次干燥通過解吸去除未冷凍的結(jié)合水，以避免儲存期間出現(xiàn)蛋白質(zhì)穩(wěn)定性問題。為了避免樣品崩潰，應(yīng)逐漸提高板層溫度，一般不超過50°C，時間通常不超過6h。干燥結(jié)束后，產(chǎn)品中的殘留水分為應(yīng)符合要求。根據(jù)QbD原則，過程分析技術(shù)的主要目的是提高過程效率并保證產(chǎn)品的關(guān)鍵質(zhì)量屬性。近年來，已經(jīng)開發(fā)出用于在線和實(shí)時測量的新工具，如溫度遠(yuǎn)程監(jiān)控系統(tǒng)和TrackSense Pro系統(tǒng)，基于對產(chǎn)品溫度、板層溫度和腔室壓力的監(jiān)控，可以確定一次干燥甚至二次干燥的終點(diǎn)。LyoTrack系統(tǒng)基于光學(xué)發(fā)射光譜測量干燥室內(nèi)的水分濃度，從而獲得更準(zhǔn)確的干燥終點(diǎn)。壓力溫度測量是一種壓力上升測試，當(dāng)干燥室中的蒸汽壓力不再上升時，初級干燥完成。此外，通過使用近紅外和拉曼探頭，可以監(jiān)測凍干配方的中間參數(shù)，例如過程誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)變、結(jié)晶、固態(tài)化、多晶型轉(zhuǎn)化和殘余水分含量。過程分析技術(shù)工具以及相應(yīng)的屬性如下表。
三、凍干制劑輔料
選擇合適輔料能有助于產(chǎn)品在凍干過程中獲得理想的質(zhì)量屬性和穩(wěn)定性，并降低生產(chǎn)的時間和經(jīng)濟(jì)成本，提高產(chǎn)量。下圖為生物藥凍干制劑常用輔料選用：
1. 穩(wěn)定劑
凍干過程中蛋白質(zhì)的穩(wěn)定基于兩種主要機(jī)制：玻璃化和水置換理論。玻璃化定義了蛋白質(zhì)分子在由無定形穩(wěn)定劑形成的基質(zhì)中的固定化，從而降低蛋白質(zhì)分子之間的相互作用，從而防止其結(jié)構(gòu)的變化。水置換機(jī)制是基于穩(wěn)定劑糖的羥基和蛋白質(zhì)的極性基團(tuán)之間氫鍵的形成，在干燥過程中取代了水和蛋白質(zhì)之間的氫鍵，從而允許保留蛋白質(zhì)分子的天然形式。玻璃化理論代表動力學(xué)穩(wěn)定，而水替代理論代表穩(wěn)定的熱力學(xué)方面，動力學(xué)穩(wěn)定與Tg密切相關(guān)。Tg的測定對于選擇適當(dāng)?shù)膬Υ婧瓦\(yùn)輸條件至關(guān)重要。在凍結(jié)態(tài)下，無定形輔料和蛋白質(zhì)形成玻璃狀基質(zhì)溫度低于該溫度Tg。但即使在低于Tg的溫度下，蛋白質(zhì)遷移也可以加速降解反應(yīng)。蛋白質(zhì)會增加制劑處方的Tg，需要添加Tg值相對較高的輔料以保持蛋白質(zhì)穩(wěn)定性，特別是在高濃度蛋白質(zhì)制劑中。研究顯示，在蔗糖作為穩(wěn)定劑制劑中添加山梨糖醇而增加的分子遷移率不會影響在Tg溫度下儲存的蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性，這表明遷移率（即動力學(xué)穩(wěn)定）對于蛋白質(zhì)穩(wěn)定性并不重要。此外，最終產(chǎn)品的水含量應(yīng)在最佳范圍內(nèi)，過度干燥不利于蛋白質(zhì)穩(wěn)定性。不建議以<1% （w/v）為干燥最終水分控制標(biāo)準(zhǔn)，但較高的殘留水也會降低儲存條件下制劑處方的Tg從而降低蛋白質(zhì)穩(wěn)定性。因此，需要選擇凍干過程中最佳的二次干燥條件，以保證合適水分量的控制【1】。
臨界溫度Tg'和Tc也是穩(wěn)定劑的重要特性，它們決定了凍干過程的溫度條件和干燥周期的持續(xù)時間。較高Tg'和Tc的穩(wěn)定劑有助于減少凍干時間，通常為了得到合適的干燥時間，穩(wěn)定劑的Tg'不應(yīng)小于-40°C。加入具有較高臨界溫度的輔料可以在較高的產(chǎn)品溫度Tp（高于Tg'，甚至高于Tc）下進(jìn)行初級干燥，從而縮短初級干燥時間而不會發(fā)生塌陷。蔗糖和海藻糖在凍干過程和儲存過程中對增加蛋白質(zhì)穩(wěn)定性都非常明顯。主要原因是這兩種糖在凍干過程中不易結(jié)晶，從而不會與蛋白質(zhì)相分離。不建議使用結(jié)晶性的填充劑作為穩(wěn)定劑，如甘露醇和甘氨酸。與海藻糖相比，蔗糖更便宜經(jīng)濟(jì)。海藻糖作為穩(wěn)定劑的優(yōu)勢在于其較高Tg為111°C，而蔗糖Tg為65°C【2】。
保證穩(wěn)定性的重要因素是穩(wěn)定劑和蛋白質(zhì)之間的適當(dāng)比例。糖和蛋白質(zhì)之間的摩爾比應(yīng)至少為360：1【3】。添加過量糖會降低Tg'。優(yōu)化凍干過程的方法是選擇具有高穩(wěn)定性效果和高臨界溫度T?和Tc的替代輔料，高于蔗糖和海藻糖。包含具有高Tg'和Tc改性劑的輔料，允許產(chǎn)品在更高的干燥溫度下進(jìn)行初級干燥而不會破壞產(chǎn)品結(jié)構(gòu)。此外，Tc改性劑和填充劑通過形成晶格的組合可以在產(chǎn)品溫度高于Tc的情況下進(jìn)行初級干燥，而不影響蛋白質(zhì)穩(wěn)定性和不發(fā)生塌陷【4】。下表列出的穩(wěn)定劑輔料（除山梨醇外）Tg'都高于蔗糖（這意味著可能使用更高的干燥溫度來縮短干燥過程）。為了確保蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性并防止相分離，建議將蔗糖和葡聚糖結(jié)合使用【2】。
聚乙烯吡咯烷酮PVP也是一種可用于穩(wěn)定劑的聚合物，它可以抑制緩沖鹽的結(jié)晶，PVP通常與糖結(jié)合使用。對于腸外劑型，由于易在體內(nèi)積聚不推薦使用高分子量PVP【5】。羥丙基-β-環(huán)糊精可以作為穩(wěn)定劑或表面活性劑，通過水替代理論和增加凍干體系Tg來穩(wěn)定蛋白質(zhì)。如果將環(huán)糊精用作凍干保護(hù)劑，則濃度通常在1-10%（w / v）。環(huán)糊精還能限制已經(jīng)具有結(jié)晶傾向的穩(wěn)定劑結(jié)晶，因此其主要幫助在生產(chǎn)和儲存過程中蛋白質(zhì)保持穩(wěn)定。羥丙基-β-環(huán)糊精的兩親性質(zhì)通過防止蛋白質(zhì)在界面處展開和聚集，從而在冷凍、干燥和復(fù)溶過程中增加蛋白質(zhì)穩(wěn)定性，從而起到表面活性劑的作用。除了與蛋白質(zhì)相互作用外，它還降低了表面張力，從而防止空氣/水、冰/水和固體/空氣界面的不穩(wěn)定。研究顯示羥丙基-β-環(huán)糊精在低濃度（0.1% w/v）下能表現(xiàn)出表面活性劑作用【6】。下表列出生物凍干制劑中的各種穩(wěn)定劑及其關(guān)鍵參數(shù)。
在氨基酸中，最常用作穩(wěn)定劑的是甘氨酸、組氨酸和精氨酸。組氨酸在保持在無定形狀態(tài)時作為緩沖液和冷凍/凍干保護(hù)劑，以及作為抗氧化劑。在凍干制劑中，甘氨酸通常作為填充劑或緩沖劑添加，而其穩(wěn)定特性顯示出與糖的協(xié)同作用。精氨酸穩(wěn)定作用是基于其與蛋白質(zhì)表面的弱結(jié)合，可以防止蛋白質(zhì)相互作用和聚集，同時它在凍干期間和之后表現(xiàn)為無定形狀態(tài)。在用于皮下給藥的高濃度蛋白質(zhì)制劑方面精氨酸使用較多，鹽酸精氨酸降低制劑的粘度并有助于增加蛋白質(zhì)溶解度。此外，脯 氨酸、丙氨酸、絲氨酸、苯丙氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、賴氨酸和纈氨酸等氨基酸也可能被用作穩(wěn)定劑，通常為了增強(qiáng)蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性而與二糖聯(lián)合使用。除精氨酸鹽酸鹽、賴氨酸鹽酸鹽、組氨酸鹽酸鹽可作為降粘劑外，不同的鹽（NaCl、NaAc、Na2所以4和 NH4Cl）以及將一些輔料改性成疏水鹽也可以降低高濃度蛋白的粘度【2】【7】。
2. 填充劑
填充劑能為凍干餅提供適當(dāng)?shù)慕Y(jié)構(gòu)，有助于凍干餅塊的適當(dāng)形態(tài)，形成孔結(jié)構(gòu)，孔隙率是冷凍水升華的先決條件，較大的孔隙可以更快地升華，因此可以減少初級干燥時間。添加填充劑可實(shí)現(xiàn)更短的初級干燥（產(chǎn)品溫度Tp?Tg'或Tc）時間，可作為優(yōu)化生物制藥凍干過程的方法。
通常穩(wěn)定劑與填充劑的比例應(yīng)至少為1：2，以提供必要的填充劑結(jié)晶。形成的晶格為處于無定形狀態(tài)的成分提供機(jī)械支撐。在Tg'上方，制劑體系形成的無定形狀態(tài)剛性不夠，無法支撐其自身重量，并且會坍縮到晶體網(wǎng)絡(luò)上。由于機(jī)械支撐，盡管干燥溫度高于Tg'（甚至高于Tc），但仍可以防止塌陷發(fā)生。在蛋白質(zhì)濃度<50 mg/mL的處方中，添加填充劑尤為重要，因?yàn)樵诘鞍踪|(zhì)濃度較高的配方中體系的Tg′會增加。但如果填充劑在凍干過程中保持無定形狀態(tài)，由于儲存過程中潛在的結(jié)晶，可能會影響蛋白質(zhì)穩(wěn)定性，因此，通常加入退火步驟可促進(jìn)填充劑的結(jié)晶。市售產(chǎn)品大多以甘露醇或甘氨酸作為填充劑，因?yàn)樗鼈兙哂懈呓Y(jié)晶傾向。甘露醇/冰和甘氨酸/冰混合物具有較高的共晶熔融溫度，分別為-1.5°C和-4°C。即使甘氨酸的部分結(jié)晶（蔗糖與甘氨酸的比例為2：1）也能使體系在更高的干燥條件下進(jìn)行而不會對凍干餅結(jié)構(gòu)產(chǎn)生影響。與未退火的無定形制劑相比，退火后部分結(jié)晶的甘露醇有助于縮短高濃度蛋白質(zhì)制劑的復(fù)溶時間。但是填充劑的物理狀態(tài)還取決于蛋白質(zhì)的類型、濃度、pH和緩沖液濃度。研究顯示將凍干溶液中的pH值從5.9降低到3.0，并將磷酸鹽緩沖液濃度從50mM增加到250mM會降低甘氨酸結(jié)晶速率【8】。
填充劑對蛋白質(zhì)穩(wěn)定性的影響很?。ㄌ畛鋭┑慕Y(jié)晶度增加還是會或多或少導(dǎo)致蛋白質(zhì)物理穩(wěn)定性降低）或沒有影響。因此需要選擇合適的填充劑和穩(wěn)定劑，由于二者的協(xié)同作用，含有穩(wěn)定劑和填充劑的配方有助于提高物理穩(wěn)定性。但是當(dāng)使用的穩(wěn)定劑阻止填充劑結(jié)晶導(dǎo)致支撐非晶相的晶格無法形成時，將會影響初級干燥溫度。研究發(fā)現(xiàn)添加甘露醇作為填充劑幾乎不會損害蛋白質(zhì)穩(wěn)定性，同時防止在凍干中塌陷【9】。
除了甘露醇和甘氨酸，葡聚糖和PEG，苯丙氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、蛋氨酸、精氨酸和組氨酸等氨基酸也可以作為填充劑。研究顯示，與甘氨酸和甘露醇相比，其他作為填充劑的氨基酸可以在較低的濃度下結(jié)晶，蔗糖與氨基酸的比例為2.5-47.5已被證明足以促進(jìn)結(jié)晶。但為了得到更好的外觀和是蛋白質(zhì)穩(wěn)定性更好，蔗糖與氨基酸（即亮氨酸、異亮氨酸、苯丙氨酸）的最佳比例為4：1【10】。
3. 緩沖劑
緩沖劑的作用是將溶液的pH值維持在保持蛋白質(zhì)具有較好穩(wěn)定性的條件?？筛鶕?jù)蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)選擇溶液的pH，為了防止使用后的刺激，疼痛和副作用，pH需要在人體生理可接受范圍內(nèi)。結(jié)合目前已上市的生物制劑以及相關(guān)研究，生物蛋白質(zhì)藥物大多緩沖區(qū)間在pH4.6-8.2范圍內(nèi)。蛋白質(zhì)分子在凍干、復(fù)溶和儲存過程中暴露于不同的降解條件，因此選擇合適的緩沖液至關(guān)重要。
對于凍干制劑，最常用的緩沖液是非氨基酸緩沖液，例如磷酸緩沖液、乙酸緩沖液、檸檬酸緩沖液和琥珀酸緩沖液。對于氨基酸緩沖液的使用，組氨酸緩沖液是使用最廣泛的。檸檬酸鹽緩沖液通常是最先考慮的，因?yàn)樗柠}組分在冷凍過程中表現(xiàn)出低結(jié)晶傾向，并且具有高臨界溫度Tc，這有助于縮短初級干燥時間。在冷凍過程中需要避免緩沖鹽的結(jié)晶，因?yàn)榻Y(jié)晶會改變體系pH值并導(dǎo)致蛋白質(zhì)不穩(wěn)定（在磷酸鈉溶液的冷凍過程中，二鈉鹽的結(jié)晶會導(dǎo)致pH值降低至3個pH單位）。雖然一些情況下添加填充劑如甘露醇和甘氨酸，可能會促進(jìn)緩沖鹽結(jié)晶，但填充劑對緩沖鹽的結(jié)晶影響主要取決于填充劑的濃度，濃度<50 mM的甘氨酸抑制磷酸鹽緩沖液中二鈉鹽的結(jié)晶，而當(dāng)濃度較高時，結(jié)晶速率明顯增加，如下圖。此外，冷凍過程中磷酸鹽緩沖液的急劇pH變化也會導(dǎo)致蛋白質(zhì)的不穩(wěn)定，但通常加入穩(wěn)定劑后處于無定型狀態(tài)的穩(wěn)定劑能很大程度緩解緩沖液結(jié)晶和pH變化引起的蛋白質(zhì)不穩(wěn)定，各輔料起到協(xié)同作用【11】。
此外，當(dāng)緩沖液處于非結(jié)晶狀態(tài)下時，其pH對溫度敏感性也值得關(guān)注，非結(jié)晶狀態(tài)下，Tris緩沖液比磷酸鹽緩沖液更容易受溫度影響。當(dāng)溫度降低時，Tris（PKa7.4）緩沖液的緩沖能力會降低，而當(dāng)溫度升高時，pH值也可能會上升，因此尤其是在配制和使用Tris緩沖液時，需要特別注意合適的溫度范圍。
4. 表面活性劑
表面活性劑在蛋白質(zhì)制劑中的作用是通過表面活性劑吸附到蛋白質(zhì)表面的疏水區(qū)域或冰/空氣和水之間的界面來防止蛋白質(zhì)表面聚集。表面活性劑增加了蛋白質(zhì)展開所需的自由能，并降低了凍干和復(fù)溶過程中形成界面的表面張力。在復(fù)溶過程中，有助于凍干餅塊的復(fù)溶。
與離子表面活性劑相比，非離子性質(zhì)不會促進(jìn)蛋白質(zhì)變性如聚山梨酯80和20是最常用的。使用聚山梨酯時，必須考慮其對氧化和水解的敏感性。其可能形成的降解產(chǎn)物（例如，過氧化氫，甲酸）會對蛋白質(zhì)穩(wěn)定性產(chǎn)生影響。此外，還需要考慮聚山梨酯的成分、等級和來源。藥典規(guī)定，聚山梨酯80（II）含油酸應(yīng)不低于98.0%，含肉豆蔻酸、棕櫚酸、棕櫚油酸、硬脂酸、亞油酸與亞麻酸均不得超過0.5%。而聚山梨酯20含月桂酸應(yīng)為40.0%～60.0%，含肉豆蔻酸應(yīng)為14.0%～25.0%，含棕櫚酸應(yīng)為7.0%～15.0%，含己酸、辛酸、癸酸、硬脂酸、油酸與亞油酸分別不得過1.0%、10.0%、10.0%、7.0%、11.0%與3.0%。此外，泊洛沙姆是可以代替聚山梨酯使用的比較有前景的表面活性劑，但是目前它們在市售產(chǎn)品中的使用量很低。
在凍干過程中，藥物制劑中的蛋白質(zhì)分子可能會受到不同因素影響，包括pH，脫水，離子強(qiáng)度增加，水/冰界面的形成和溫度變化。通過選用合適的輔料，不僅可以提高生物制藥的穩(wěn)定性，還可以影響凍干過程的參數(shù)。因此，這些輔料對于降低成本凍干工藝至關(guān)重要，這些工藝可提供具有可接受的凍干餅結(jié)構(gòu)和所需關(guān)鍵質(zhì)量屬性的穩(wěn)定產(chǎn)品。最重要的輔料是穩(wěn)定劑。除蔗糖和海藻糖外，具有較高T?和Tc的新型穩(wěn)定劑如PEG，低分子量PVP和環(huán)糊精等能夠使產(chǎn)品在相對較高溫度下進(jìn)行初級干燥，從而縮短初級干燥時間，這從工業(yè)角度來看尤為重要。穩(wěn)定劑為蛋白質(zhì)分子提供穩(wěn)定性，填充劑負(fù)責(zé)有助于凍干餅的合適外觀和孔隙率，以及無定形材料的機(jī)械支撐，從而有助于縮短初級干燥時間。從生物制藥皮下應(yīng)用的當(dāng)代趨勢來看，新型輔料也越來越受到關(guān)注，特別是在高濃度蛋白質(zhì)配方方面。
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