生物制藥市場正在迅速增長，預計在2018年至2024年之間，復合年增長率為8.6％，到2024年將達到3,900億美元。單克隆抗體（mAB）是市場上的主要蛋白質類型藥物，占總市場的四分之一。單克隆抗體領域始于30年前，批準了用于預防腎臟移植排斥反應的Orthoclone OKT3，此后，每年都有三到五種基于單抗的新產品獲批。目前，藥品市場以生產生物仿制藥為導向，預計蛋白質藥物的數量將進一步增長。生物大分子分子量大且不穩定，通常采用腸胃外給藥。蛋白質的穩定性是生物制藥設計和開發的主要出發點。凍干是制造穩定的生物制藥產品的首選方法，目前50%的生物藥采用凍干制劑從而保證其使用穩定性。由于生物藥的復雜性和敏感性，通常加入藥物特異性輔料來優化凍干過程，以使其生物活性成分穩定。例如，皮下注射治療性蛋白藥物由于粘度高導致可注射性降低和復溶時間增長，需要加入降粘劑，以降低溶液粘度。
一、生物制劑處方穩定性
溶液中的蛋白質通常不穩定，凍干是實現穩定生物制藥配方的主要方法，但受凍干條件影響，蛋白質分子可能會不穩定?；瘜W不穩定性會導致肽共價鍵的形成或破壞，從而產生新的化學體。常見的過程包括氧化、脫酰胺和異構化。脫酰胺容易發生在中性和堿性pH值下，堿性條件下的脫酰胺比例是酸性條件下的三倍。異構化通常發生在中性或酸性條件下，可能導致蛋白分子的親和力降低。物理不穩定會導致蛋白質變性和聚集，影響物理穩定性的因素包括 pH 值、溫度、離子強度、凍融、蛋白質濃度和機械應力。糖、聚合物、表面活性劑、多元醇和氨基酸等輔料對于在凍干和儲存期間穩定生物蛋白制劑至關重要，但由于腸外制劑的監管要求，其選擇十分有限。
二、凍干過程
凍干是在冷凍后通過升華從生物制藥藥物中去除水分的過程，這種技術的時間和經濟成本通常較高。凍干過程包括冷凍、初級和次級干燥步驟。
冷凍步驟旨在將大部分水變成冰，形成凍結濃縮溶液。冷凍期間的溫度必須設置在最大凍結濃度溶液的玻璃化轉變溫度和結晶材料的共晶溫度以下。退火是冷凍后執行的一步，可形成更大、更均勻的冰晶并使填充劑結晶，從而提高初級干燥的效率。冷凍過程中蛋白質分子所在的體系特性會發生變化，影響產品的穩定性。冷卻速度會影響冰晶的大小和形態，進而影響凍干的干燥階段。蛋白質濃度、類型和退火步驟的加入也會影響產品復溶時間。
初級干燥通過升華去除冷凍的游離水，適當選擇板層溫度和壓力值可以縮短該過程。初級干燥是凍干過程中最耗時和能量的階段，通常最佳壓力為0.1-0.2 mbar，板層溫度選擇基于玻璃化轉變溫度Tg'和塌陷溫度Tc。通常將產品溫度保持在Tg'以下2-3°C以保持蛋白質穩定性，但是適當的處方優化甚至允許產品在Tg'或Tc以上進行干燥。當產品溫度Tp等于板層溫度時，初級干燥即完成。通常Tg'和Tc可以分別通過差示掃描量熱法和凍干顯微鏡來確定。
二次干燥通過解吸去除未冷凍的結合水，以避免儲存期間出現蛋白質穩定性問題。為了避免樣品崩潰，應逐漸提高板層溫度，一般不超過50°C，時間通常不超過6h。干燥結束后，產品中的殘留水分為應符合要求。根據QbD原則，過程分析技術的主要目的是提高過程效率并保證產品的關鍵質量屬性。近年來，已經開發出用于在線和實時測量的新工具，如溫度遠程監控系統和TrackSense Pro系統，基于對產品溫度、板層溫度和腔室壓力的監控，可以確定一次干燥甚至二次干燥的終點。LyoTrack系統基于光學發射光譜測量干燥室內的水分濃度，從而獲得更準確的干燥終點。壓力溫度測量是一種壓力上升測試，當干燥室中的蒸汽壓力不再上升時，初級干燥完成。此外，通過使用近紅外和拉曼探頭，可以監測凍干配方的中間參數，例如過程誘導的轉變、結晶、固態化、多晶型轉化和殘余水分含量。過程分析技術工具以及相應的屬性如下表。
三、凍干制劑輔料
選擇合適輔料能有助于產品在凍干過程中獲得理想的質量屬性和穩定性，并降低生產的時間和經濟成本，提高產量。下圖為生物藥凍干制劑常用輔料選用：
1. 穩定劑
凍干過程中蛋白質的穩定基于兩種主要機制：玻璃化和水置換理論。玻璃化定義了蛋白質分子在由無定形穩定劑形成的基質中的固定化，從而降低蛋白質分子之間的相互作用，從而防止其結構的變化。水置換機制是基于穩定劑糖的羥基和蛋白質的極性基團之間氫鍵的形成，在干燥過程中取代了水和蛋白質之間的氫鍵，從而允許保留蛋白質分子的天然形式。玻璃化理論代表動力學穩定，而水替代理論代表穩定的熱力學方面，動力學穩定與Tg密切相關。Tg的測定對于選擇適當的儲存和運輸條件至關重要。在凍結態下，無定形輔料和蛋白質形成玻璃狀基質溫度低于該溫度Tg。但即使在低于Tg的溫度下，蛋白質遷移也可以加速降解反應。蛋白質會增加制劑處方的Tg，需要添加Tg值相對較高的輔料以保持蛋白質穩定性，特別是在高濃度蛋白質制劑中。研究顯示，在蔗糖作為穩定劑制劑中添加山梨糖醇而增加的分子遷移率不會影響在Tg溫度下儲存的蛋白質的穩定性，這表明遷移率（即動力學穩定）對于蛋白質穩定性并不重要。此外，最終產品的水含量應在最佳范圍內，過度干燥不利于蛋白質穩定性。不建議以<1% （w/v）為干燥最終水分控制標準，但較高的殘留水也會降低儲存條件下制劑處方的Tg從而降低蛋白質穩定性。因此，需要選擇凍干過程中最佳的二次干燥條件，以保證合適水分量的控制【1】。
臨界溫度Tg'和Tc也是穩定劑的重要特性，它們決定了凍干過程的溫度條件和干燥周期的持續時間。較高Tg'和Tc的穩定劑有助于減少凍干時間，通常為了得到合適的干燥時間，穩定劑的Tg'不應小于-40°C。加入具有較高臨界溫度的輔料可以在較高的產品溫度Tp（高于Tg'，甚至高于Tc）下進行初級干燥，從而縮短初級干燥時間而不會發生塌陷。蔗糖和海藻糖在凍干過程和儲存過程中對增加蛋白質穩定性都非常明顯。主要原因是這兩種糖在凍干過程中不易結晶，從而不會與蛋白質相分離。不建議使用結晶性的填充劑作為穩定劑，如甘露醇和甘氨酸。與海藻糖相比，蔗糖更便宜經濟。海藻糖作為穩定劑的優勢在于其較高Tg為111°C，而蔗糖Tg為65°C【2】。
保證穩定性的重要因素是穩定劑和蛋白質之間的適當比例。糖和蛋白質之間的摩爾比應至少為360：1【3】。添加過量糖會降低Tg'。優化凍干過程的方法是選擇具有高穩定性效果和高臨界溫度T?和Tc的替代輔料，高于蔗糖和海藻糖。包含具有高Tg'和Tc改性劑的輔料，允許產品在更高的干燥溫度下進行初級干燥而不會破壞產品結構。此外，Tc改性劑和填充劑通過形成晶格的組合可以在產品溫度高于Tc的情況下進行初級干燥，而不影響蛋白質穩定性和不發生塌陷【4】。下表列出的穩定劑輔料（除山梨醇外）Tg'都高于蔗糖（這意味著可能使用更高的干燥溫度來縮短干燥過程）。為了確保蛋白質的穩定性并防止相分離，建議將蔗糖和葡聚糖結合使用【2】。
聚乙烯吡咯烷酮PVP也是一種可用于穩定劑的聚合物，它可以抑制緩沖鹽的結晶，PVP通常與糖結合使用。對于腸外劑型，由于易在體內積聚不推薦使用高分子量PVP【5】。羥丙基-β-環糊精可以作為穩定劑或表面活性劑，通過水替代理論和增加凍干體系Tg來穩定蛋白質。如果將環糊精用作凍干保護劑，則濃度通常在1-10%（w / v）。環糊精還能限制已經具有結晶傾向的穩定劑結晶，因此其主要幫助在生產和儲存過程中蛋白質保持穩定。羥丙基-β-環糊精的兩親性質通過防止蛋白質在界面處展開和聚集，從而在冷凍、干燥和復溶過程中增加蛋白質穩定性，從而起到表面活性劑的作用。除了與蛋白質相互作用外，它還降低了表面張力，從而防止空氣/水、冰/水和固體/空氣界面的不穩定。研究顯示羥丙基-β-環糊精在低濃度（0.1% w/v）下能表現出表面活性劑作用【6】。下表列出生物凍干制劑中的各種穩定劑及其關鍵參數。
在氨基酸中，最常用作穩定劑的是甘氨酸、組氨酸和精氨酸。組氨酸在保持在無定形狀態時作為緩沖液和冷凍/凍干保護劑，以及作為抗氧化劑。在凍干制劑中，甘氨酸通常作為填充劑或緩沖劑添加，而其穩定特性顯示出與糖的協同作用。精氨酸穩定作用是基于其與蛋白質表面的弱結合，可以防止蛋白質相互作用和聚集，同時它在凍干期間和之后表現為無定形狀態。在用于皮下給藥的高濃度蛋白質制劑方面精氨酸使用較多，鹽酸精氨酸降低制劑的粘度并有助于增加蛋白質溶解度。此外，脯 氨酸、丙氨酸、絲氨酸、苯丙氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、賴氨酸和纈氨酸等氨基酸也可能被用作穩定劑，通常為了增強蛋白質的穩定性而與二糖聯合使用。除精氨酸鹽酸鹽、賴氨酸鹽酸鹽、組氨酸鹽酸鹽可作為降粘劑外，不同的鹽（NaCl、NaAc、Na2所以4和 NH4Cl）以及將一些輔料改性成疏水鹽也可以降低高濃度蛋白的粘度【2】【7】。
2. 填充劑
填充劑能為凍干餅提供適當的結構，有助于凍干餅塊的適當形態，形成孔結構，孔隙率是冷凍水升華的先決條件，較大的孔隙可以更快地升華，因此可以減少初級干燥時間。添加填充劑可實現更短的初級干燥（產品溫度Tp?Tg'或Tc）時間，可作為優化生物制藥凍干過程的方法。
通常穩定劑與填充劑的比例應至少為1：2，以提供必要的填充劑結晶。形成的晶格為處于無定形狀態的成分提供機械支撐。在Tg'上方，制劑體系形成的無定形狀態剛性不夠，無法支撐其自身重量，并且會坍縮到晶體網絡上。由于機械支撐，盡管干燥溫度高于Tg'（甚至高于Tc），但仍可以防止塌陷發生。在蛋白質濃度<50 mg/mL的處方中，添加填充劑尤為重要，因為在蛋白質濃度較高的配方中體系的Tg′會增加。但如果填充劑在凍干過程中保持無定形狀態，由于儲存過程中潛在的結晶，可能會影響蛋白質穩定性，因此，通常加入退火步驟可促進填充劑的結晶。市售產品大多以甘露醇或甘氨酸作為填充劑，因為它們具有高結晶傾向。甘露醇/冰和甘氨酸/冰混合物具有較高的共晶熔融溫度，分別為-1.5°C和-4°C。即使甘氨酸的部分結晶（蔗糖與甘氨酸的比例為2：1）也能使體系在更高的干燥條件下進行而不會對凍干餅結構產生影響。與未退火的無定形制劑相比，退火后部分結晶的甘露醇有助于縮短高濃度蛋白質制劑的復溶時間。但是填充劑的物理狀態還取決于蛋白質的類型、濃度、pH和緩沖液濃度。研究顯示將凍干溶液中的pH值從5.9降低到3.0，并將磷酸鹽緩沖液濃度從50mM增加到250mM會降低甘氨酸結晶速率【8】。
填充劑對蛋白質穩定性的影響很小（填充劑的結晶度增加還是會或多或少導致蛋白質物理穩定性降低）或沒有影響。因此需要選擇合適的填充劑和穩定劑，由于二者的協同作用，含有穩定劑和填充劑的配方有助于提高物理穩定性。但是當使用的穩定劑阻止填充劑結晶導致支撐非晶相的晶格無法形成時，將會影響初級干燥溫度。研究發現添加甘露醇作為填充劑幾乎不會損害蛋白質穩定性，同時防止在凍干中塌陷【9】。
除了甘露醇和甘氨酸，葡聚糖和PEG，苯丙氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、蛋氨酸、精氨酸和組氨酸等氨基酸也可以作為填充劑。研究顯示，與甘氨酸和甘露醇相比，其他作為填充劑的氨基酸可以在較低的濃度下結晶，蔗糖與氨基酸的比例為2.5-47.5已被證明足以促進結晶。但為了得到更好的外觀和是蛋白質穩定性更好，蔗糖與氨基酸（即亮氨酸、異亮氨酸、苯丙氨酸）的最佳比例為4：1【10】。
3. 緩沖劑
緩沖劑的作用是將溶液的pH值維持在保持蛋白質具有較好穩定性的條件?？筛鶕鞍踪|的等電點選擇溶液的pH，為了防止使用后的刺激，疼痛和副作用，pH需要在人體生理可接受范圍內。結合目前已上市的生物制劑以及相關研究，生物蛋白質藥物大多緩沖區間在pH4.6-8.2范圍內。蛋白質分子在凍干、復溶和儲存過程中暴露于不同的降解條件，因此選擇合適的緩沖液至關重要。
對于凍干制劑，最常用的緩沖液是非氨基酸緩沖液，例如磷酸緩沖液、乙酸緩沖液、檸檬酸緩沖液和琥珀酸緩沖液。對于氨基酸緩沖液的使用，組氨酸緩沖液是使用最廣泛的。檸檬酸鹽緩沖液通常是最先考慮的，因為它的鹽組分在冷凍過程中表現出低結晶傾向，并且具有高臨界溫度Tc，這有助于縮短初級干燥時間。在冷凍過程中需要避免緩沖鹽的結晶，因為結晶會改變體系pH值并導致蛋白質不穩定（在磷酸鈉溶液的冷凍過程中，二鈉鹽的結晶會導致pH值降低至3個pH單位）。雖然一些情況下添加填充劑如甘露醇和甘氨酸，可能會促進緩沖鹽結晶，但填充劑對緩沖鹽的結晶影響主要取決于填充劑的濃度，濃度<50 mM的甘氨酸抑制磷酸鹽緩沖液中二鈉鹽的結晶，而當濃度較高時，結晶速率明顯增加，如下圖。此外，冷凍過程中磷酸鹽緩沖液的急劇pH變化也會導致蛋白質的不穩定，但通常加入穩定劑后處于無定型狀態的穩定劑能很大程度緩解緩沖液結晶和pH變化引起的蛋白質不穩定，各輔料起到協同作用【11】。
此外，當緩沖液處于非結晶狀態下時，其pH對溫度敏感性也值得關注，非結晶狀態下，Tris緩沖液比磷酸鹽緩沖液更容易受溫度影響。當溫度降低時，Tris（PKa7.4）緩沖液的緩沖能力會降低，而當溫度升高時，pH值也可能會上升，因此尤其是在配制和使用Tris緩沖液時，需要特別注意合適的溫度范圍。
4. 表面活性劑
表面活性劑在蛋白質制劑中的作用是通過表面活性劑吸附到蛋白質表面的疏水區域或冰/空氣和水之間的界面來防止蛋白質表面聚集。表面活性劑增加了蛋白質展開所需的自由能，并降低了凍干和復溶過程中形成界面的表面張力。在復溶過程中，有助于凍干餅塊的復溶。
與離子表面活性劑相比，非離子性質不會促進蛋白質變性如聚山梨酯80和20是最常用的。使用聚山梨酯時，必須考慮其對氧化和水解的敏感性。其可能形成的降解產物（例如，過氧化氫，甲酸）會對蛋白質穩定性產生影響。此外，還需要考慮聚山梨酯的成分、等級和來源。藥典規定，聚山梨酯80（II）含油酸應不低于98.0%，含肉豆蔻酸、棕櫚酸、棕櫚油酸、硬脂酸、亞油酸與亞麻酸均不得超過0.5%。而聚山梨酯20含月桂酸應為40.0%～60.0%，含肉豆蔻酸應為14.0%～25.0%，含棕櫚酸應為7.0%～15.0%，含己酸、辛酸、癸酸、硬脂酸、油酸與亞油酸分別不得過1.0%、10.0%、10.0%、7.0%、11.0%與3.0%。此外，泊洛沙姆是可以代替聚山梨酯使用的比較有前景的表面活性劑，但是目前它們在市售產品中的使用量很低。
在凍干過程中，藥物制劑中的蛋白質分子可能會受到不同因素影響，包括pH，脫水，離子強度增加，水/冰界面的形成和溫度變化。通過選用合適的輔料，不僅可以提高生物制藥的穩定性，還可以影響凍干過程的參數。因此，這些輔料對于降低成本凍干工藝至關重要，這些工藝可提供具有可接受的凍干餅結構和所需關鍵質量屬性的穩定產品。最重要的輔料是穩定劑。除蔗糖和海藻糖外，具有較高T?和Tc的新型穩定劑如PEG，低分子量PVP和環糊精等能夠使產品在相對較高溫度下進行初級干燥，從而縮短初級干燥時間，這從工業角度來看尤為重要。穩定劑為蛋白質分子提供穩定性，填充劑負責有助于凍干餅的合適外觀和孔隙率，以及無定形材料的機械支撐，從而有助于縮短初級干燥時間。從生物制藥皮下應用的當代趨勢來看，新型輔料也越來越受到關注，特別是在高濃度蛋白質配方方面。
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