一、簡介
新冠肺炎NMR聯合會是一個由NMR專家組成的國際合作組織。目前，該組織正在積極開展研究，通過利用NMR波譜來確定SARS-CoV-2及其蛋白質的核糖核酸（RNA）結構。在疫情初期，聯合會的首批成果之一是發現SARS-CoV-2中的一種蛋白質會與病毒RNA形成微滴。在隨后的幾個月里，這一發現使科學家能夠創建實驗來研究RNA與蛋白質（稱為核衣殼蛋白或N蛋白）之間的相互作用。
二、新冠肺炎NMR聯合會簡介
新冠肺炎NMR聯合會由Harald Schwalbe教授于2020年3月在德國法蘭克福的歌德大學發起，并迅速發展成為一個國際性的合作組織。今天，來自世界各地的科學家正基于開放的科學原則進行合作，以獨特的方式利用NMR波譜對SARS-CoV-2展開研究。由歌德大學的Schwalbe教授及其團隊負責協調該項目的宗旨與共同的科學目標。核心團隊包括來自達姆施塔特和法蘭克福的五位教授和初級小組負責人，以及來自法蘭克福生物磁共振中心（BMRZ）的九位高級科學家。該聯合會的總體目標是通過聯合各方力量，盡快在新冠肺炎研究中取得有意義的科學成果。
應Schwalbe教授的邀請，Markus Zweckstetter教授于2020年底在發表SARS-CoV-2研究成果之后加入了該聯合會。作為由50多位NMR專家構成的國際合作的一員，德國哥廷根的馬克斯·普朗克多學科科學研究所的Zweckstetter教授及其團隊一直在探索Covid-19隱藏的作用機制。這些研究人員借助于世界上僅有的幾臺1.2 GHzNMR儀器之一，試圖闡明SARS-CoV-2病毒中核衣殼蛋白的結構和相互作用，并以此確定有前景的候選藥物靶點。
三、Covid-19的致病機理
Covid-19疫情的病原體是嚴重急性呼吸綜合征2型冠狀病毒（SARS-CoV-2）。對SARS-CoV-2的許多早期研究都集中于所謂的“刺突蛋白”，因為它參與同宿主細胞的通訊。但隨著對SARS-CoV-2的理解不斷深入，核衣殼蛋白（又稱N蛋白）所起的關鍵作用逐漸變得清晰，因為它不僅保護RNA不被降解，而且使轉錄機制能夠聚集，從而增強其復制能力。
SARS-CoV-2的病毒膜圍繞著螺旋狀核衣殼，其中病毒基因組被核衣殼蛋白包裹。SARS-CoV-2的核衣殼蛋白在感染細胞內以很高的水平表達，提高了病毒RNA轉錄的效率，這對病毒復制至關重要。德國神經退行性疾病中心（DZNE）和馬克斯·普朗克研究所的科學家們現在已經揭示，當病毒將其內部釋放到宿主細胞中時，這種蛋白質和RNA可以共同凝結成微小的液滴。
繼續的研究表明，RNA誘導SARS-CoV-2核衣殼蛋白的協同液-液相分離，其中病毒液滴漂浮在細胞內的液體培養基中。然而，這種液滴的形成并非為冠狀病毒所特有。這種由蛋白質和其它分子組成的動態隔室自然存在于細胞內部，它們被用作儲存場所和反應室。Zweckstetter教授及其團隊的研究表明，新冠病毒也利用了這些可能性，而其它病原體同樣可能發生這種情況。
與其體外的相分離能力一致，蛋白質在細胞中與應激顆粒（通過液-液相分離形成的細胞質RNA/蛋白質顆粒）相關聯，并由病毒調節以使復制效率最大化。這一過程產生高密度蛋白質/RNA縮合物，并通過吸收SARS-CoV-2的RNA依賴性RNA聚合酶復合物，為病毒RNA提供有效的轉錄機制。因此，由小分子或生物制劑對RNA誘導的核衣殼蛋白相分離的抑制，可以對SARS-CoV-2復制循環中的關鍵步驟形成干擾。
四、確定潛在的藥物靶點
Zweckstetter教授及其團隊認為，這些發現可能為藥物開發提供了起點。得益于合作，世界各地的許多團體現在都在研究N蛋白，以評估其作為新冠肺炎治療靶點的潛力。例如，通過干擾N蛋白微滴的形成，病毒RNA可能變得更易受到外部損傷，其復制的可靠性也更低。
N蛋白研究的另一個方面是探索激酶在磷酸化N蛋白的某些殘基中的作用，因為這些酶可能是小分子抑制劑的潛在靶點。Zweckstetter教授的團隊還發現，在人體中自然存在的SRPK1激酶，會化學修飾核衣殼蛋白并影響病毒液滴的形成。
五、NMR 波譜帶來的認識
聯合會的科學家們使用NMR波譜和其它方法研究該項目，以檢測分子的結構和動力學特性。Zweckstetter小組的研究涉及了多臺從600 MHz到950 MHz的高場NMR波譜儀，這些儀器是對蛋白質進行高靈敏度研究的核心。現在，該小組可以使用哥廷根的1.2 GHzNMR儀器，他們認為，與現有的950 MHz儀器相比，該儀器將三維和更高維度NMR實驗的分辨率提高了至少兩倍。這將有助于在大的時間和長度尺度上進一步研究生物分子標記的結構動力學特性。1.2 GHzNMR儀器使用高溫超導體作為內部線圈，使用常規低溫超導體作為外部線圈，從而有可能打造出28.2特斯拉的均勻磁場。
憑借哥廷根NMR科學手段的助力，Zweckstetter教授將NMR與其它結構生物學技術相結合，從而獲得SARS-CoV-2病毒內部工作機制的更完整的視圖。例如，使用高分辨率NMR、分子動力學模擬和相分離實驗進行進一步表征，有助于查明潛在藥物如何與N蛋白相互作用，以及RNA復制是否會受到影響。
NMR為研究生物分子在溶液中的運動方式，以及其執行不同活動時采取的不同構象提供了基礎。它也有助于實時可視化分子，獲得關于它們如何發揮功能及被酶修飾的關鍵洞察。高場NMR的能力與冷凍電子顯微鏡等技術形成對比，冷凍電子顯微鏡需要冷凍樣品，因此只能提供分子作用的快照。
該團隊將分子動力學模擬與1H、13C和15N核的NMR波譜相結合，利用NOESY、HSQC和全相關譜（TOCSY）技術，對SARS-CoV-2展開了研究。圖1所示為所獲得的深度認識。
圖1：使用NMR研究SARS-CoV-2中核衣殼（NCP）蛋白A182–S197區域的特性，該區域含有高比例的絲氨酸和精氨酸（已知可結合RNA和蛋白質）。（A）化學位移分析（藍）與分子動力學模擬（紅）一致，即該區域中的殘基非常靈活，在R189旁具有小型α-螺旋結構傾向。（B）在多糖醛酸（一種簡化的RNA）存在的條件下重新運行模擬表明，精氨酸殘基和RNA磷酸基團之間存在大量的分子間接觸，其中以R189最大。這與R189是A182–S197區域中唯一未在大多數已知SARS-CoV-2菌株中突變的殘基的觀察結果一致（灰條）。
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六、未來的步驟
本項研究工作的目標是改善對新冠肺炎患者的治療。由于病毒的不斷適應和進化，產生了再次感染的風險。為了應對其帶來的威脅，聯合體計劃繼續提供數據，以探明病毒的內部工作原理，并致力于開發新的更好的藥物來治療新冠肺炎。
新冠肺炎NMR項目有著超出病毒范圍的進一步影響。盡管合作在科學中是非常重要的，但研究小組之間的固有競爭限制了合作的范圍。通常而言，科學家可能會與一、兩個其他團隊合作，但新冠肺炎聯合體表明，數十個研究團隊可以在全球范圍內展開合作的潛力。匯集專業知識、設備和試劑的能力可以加快研究進展。建立大型科學合作以應對重大挑戰可能是取得快速進展的一種補充方式，甚至可能是更有力的方式。
參考文獻
Savastano A, Ibanez de Opakua A, Rankovic M and Zweckstetter M, Nucleocapsid protein of SARS-CoV-2 phase separates into RNA-rich polymerase-containing condensates, Nature Communications, 2020, 11: 6041, https://doi.org/10.1038/s41467-020-19843-1
