近年來，3D生物打印由于可以制備用于再生醫(yī)學(xué)和疾病建模的具有多種細(xì)胞成分以及各種形態(tài)的3D組織模型，而在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用潛力越來越大。其中，生物墨水是3D生物打印的關(guān)鍵一環(huán)。由于具有仿生細(xì)胞外基質(zhì) (ECM) 特性，水凝膠是目前最常用的生物墨水。然而，水凝膠生物墨水中的游離水在低溫下會形成致命冰晶，這使冷凍保存打印出的結(jié)構(gòu)變得十分困難。此外，游離水還存在蒸發(fā)、為細(xì)菌提供生存環(huán)境等問題。這些都極大地限制了水凝膠生物墨水的實(shí)際應(yīng)用。
為解決上述問題，來自東華大學(xué)游正偉教授團(tuán)隊(duì)通過引入甘油來調(diào)節(jié)水的狀態(tài)，開發(fā)設(shè)計(jì)了一種多功能二元甘油水凝膠生物墨水。該生物墨水以明膠作為基體，以確保生物相容性。明膠通過席夫反應(yīng)與戊二醛交聯(lián)，形成相對穩(wěn)定的聚合物網(wǎng)絡(luò)。席夫堿包含動態(tài)亞胺鍵，使交聯(lián)能夠可逆地解離，并在3D打印結(jié)束后重新結(jié)合。這種動態(tài)結(jié)構(gòu)演變賦予水凝膠剪切稀化和自愈合特性，以確保其在室溫下的可印刷性。同時(shí)，甘油、水和聚合物網(wǎng)絡(luò)之間形成的大量氫鍵可以減少游離水的含量，從而顯著抑制了細(xì)菌的生長、水分的揮發(fā)和生物墨水的結(jié)晶。該論文以題為“Intrinsically cryopreservable, bacteriostatic, durable glycerohydrogel inks for 3D bioprinting”發(fā)表在Matter上。
圖1. 多功能二元甘油水凝膠生物墨水的研制
甘油水凝膠生物墨水的機(jī)械性能、剪切稀化和自愈合特性
硫酸銨可以通過誘導(dǎo)明膠分子鏈的疏水折疊來改善水凝膠的機(jī)械性能。與不含硫酸銨的甘油水凝膠（G0.6T）相比，在混合有硫酸銨的甘油水溶液中浸泡后，甘油水凝膠（NG0.6T）的拉伸強(qiáng)度和最大伸長率分別提高了2.3倍和3.5倍。亞胺鍵可以在3D打印的剪切力下可逆地解離，賦予甘油水凝膠剪切稀化特性，以防止細(xì)胞因擠壓壓力而受損（圖2C ）。此外，在交替施加低和高應(yīng)變的流變測試中，水凝膠表現(xiàn)出良好的自愈合特性，在低應(yīng)變（1 %）時(shí)迅速從類凝膠行為（G'>G"）轉(zhuǎn)變?yōu)楦邞?yīng)變（500 %）時(shí)的類溶膠行為（G'<G"），并在去除應(yīng)變后迅速恢復(fù)（圖2D）。這兩個(gè)特性賦予了水凝膠墨水在室溫下的可印刷性。
圖2. 甘油水凝膠生物墨水的機(jī)械性能、剪切稀化和自愈合特性
甘油水凝膠生物墨水的抗干燥和抗凍性能
作者將不含甘油的水凝膠和含甘油的水凝膠生物墨水置于37 ℃的干燥環(huán)境中，以評價(jià)其抗干燥性能。甘油水凝膠在3天內(nèi)保持了高透明度、高伸長率。如圖3F所示，甘油水凝膠在-80 °C下儲存后仍然保持彈性。作者使用DSC進(jìn)一步評估甘油水凝膠的抗凍性能。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在-100 °C至20 °C的DSC曲線中未檢測到甘油水凝膠的結(jié)晶峰，這表明其具有出色的低溫耐受性。
圖3. 甘油水凝膠生物墨水的抗干燥和抗凍性能
甘油水凝膠生物墨水的抑菌性能
進(jìn)一步，作者利用大腸桿菌（革蘭氏陰性）在甘油水凝膠貼片上培養(yǎng)5天后活/死細(xì)菌的染色情況和細(xì)菌生長曲線評估了甘油水凝膠生物墨水的抑菌性能。結(jié)果表明，甘油水凝膠生物墨水顯示出明顯的抑制細(xì)菌生長的作用。這主要是由于甘油的存在降低了細(xì)菌內(nèi)游離水的含量，從而導(dǎo)致滲透壓降低，細(xì)菌細(xì)胞裂解。
圖4. 甘油水凝膠生物墨水的抑菌性能
3D打印甘油水凝膠生物墨水模型的維形能力和生物相容性
作者使用甘油水凝膠生物墨水3D打印了人類心臟，在打印完成3天和21天后，心臟支架的形狀保持率分別在98.07 %和78.96 %，高于普通水凝膠生物墨水。作者發(fā)現(xiàn)由于甘油具有低滲活性可以減少細(xì)胞內(nèi)水分子的外流，甘油水凝膠生物墨水對于細(xì)胞存活和增殖十分有利。此外，作者還發(fā)現(xiàn)甘油水凝膠生物墨水可以在-80 ℃的條件下較好地保持細(xì)胞活力，并且甘油濃度的增加可以提高冷凍保存效果。
圖5. 3D打印甘油水凝膠生物墨水模型的維形能力和生物相容性
結(jié)論
作者通過使用甘油來調(diào)節(jié)生物墨水中水的狀態(tài)，成功制備出了具有優(yōu)異抑菌性能、長期維形能力和低溫保存能力的多功能甘油水凝膠生物墨水。該生物墨水有望促進(jìn)3D生物打印在體外建模和再生醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域中的實(shí)際利用。
