編者按

 

核黃素，又稱維生素B2，是一種人體必需的微量營養元素，且必須通過外源食物或營養補充劑獲取，在重體力勞動、精神緊張、懷孕及青少年生長期，人體對核黃素的需求會增加。核黃素的合成方法主要有三種，包括全化學合成法、化學半合成法和微生物發酵法，而微生物發酵法是目前核黃素的最佳生產方法。

 

中國工程院院刊《Engineering》2022年第5期刊發中國農業科學院都市農業研究所甘人友副研究員研究團隊的《微生物中核黃素合成的生物技術策略》一文。文章簡述了核黃素在人體健康中的作用及其工業生產歷史進程，詳述了核黃素在細菌和真菌中的生物合成途徑，并總結了利用現有的微生物發酵法高產核黃素的方法與策略，包括發酵條件的優化以及通過化學誘變和代謝工程技術構建核黃素高產菌株。文章指出，近年來，產核黃素微生物受到了越來越多的關注，其中，真菌（阿舒假囊酵母和棉阿舒囊霉）和細菌（枯草芽孢桿菌、大腸桿菌和乳酸菌）是理想的核黃素高產細胞工廠，因此，它們是增加發酵食品中核黃素含量或開發具有較高營養價值和人體健康益處的新型核黃素生物強化食品的優良候選菌株。利用精心挑選的菌株進行核黃素原位生產的理念，為開發面向不同或特定人群（如老年人、兒童、孕婦、運動員、素食者和青少年）的新型食品開辟了一條途徑。

 

一、引言

 

核黃素（riboflavin, RF），又稱維生素B2（圖1），是一種具有高熱穩定性（熔點為280 ℃）的水溶性B族維生素，其在酸性或中性溶液中對熱穩定，短時間內加熱不會被破壞，然而在堿性溶液中加熱卻極易被破壞。同時，核黃素也一種光敏性物質，暴露于短波輻射（< 400 nm）條件下會發生光降解。核黃素是人體必需的微量元素之一，具有廣泛的生理功能，已被世界衛生組織（WHO）列為評估人體生長、發育和營養狀況的六大指標之一。一個健康成年人的核黃素日平均需求量為0.3~1.8 mg，而當其日攝入量低于0.2~0.3 mg時，則會出現核黃素缺乏的癥狀。在某些特殊情況下，例如，重體力勞動、精神緊張、懷孕及青少年生長期，人體對核黃素的需求會增加。目前，核黃素缺乏癥已引起了全球許多國家的關注。

 

 

圖1. 核黃素的化學結構。

 

核黃素是維持細胞正常功能不可或缺的營養物質。在被攝取后，核黃素在細胞內通過黃素激酶和黃素腺嘌呤二核苷酸（FAD）合成酶的作用，分別被轉化為黃素單核苷酸（FMN）和FAD。這兩種核黃素的主要生物活性衍生物隨后作為電子載體，以及部分催化氧化還原反應的酶類（如琥珀酸脫氫酶、細胞色素c還原酶、葡萄糖氧化酶、醛氧化酶和黃嘌呤氧化酶）的必需輔助因子，參與一系列對人體新陳代謝至關重要的氧化還原反應。動物研究發現，核黃素能夠影響鐵離子的吸收和代謝，補充核黃素可以提高鋅離子和鐵離子的吸收。鑒于這兩種微量金屬元素在細胞增殖中的關鍵作用，核黃素也將間接地對生長起到積極的作用。反之，核黃素缺乏則會降低鐵離子的吸收、儲存和利用，從而導致人體生長遲緩。此外，核黃素缺乏或轉運障礙可能引發白內障、神經系統疾病、心血管異常，甚至癌癥。因此，保證有規律的核黃素日常飲食獲取對于核黃素缺乏相關疾病的預防是很有必要的。

 

核黃素與大多數維生素一樣，無法在人體內合成。因此，人體內的核黃素主要獲取自日常飲食，也可能來源于人體腸道微生物菌群。核黃素以不同的含量天然存在于各種各樣的食品中。與天然植物源性食品相比，動物源性食品是更好的核黃素來源，如內臟、牛奶和雞蛋。此外，一些綠色蔬菜和豆類中也含有一定量的核黃素。雖然日常飲食中的核黃素易于吸收，但因其水溶性而無法在人體內大量儲存，過量攝入的核黃素會隨尿液和糞便排出體外。

 

二、核黃素的生產工藝

 

2012年全球核黃素年產銷量達9000多噸，其中約1800 t用于醫藥和飲料行業，約7200 t用于動物飼料生產。隨著功能性食品和動物飼料工業的發展，核黃素的需求量也日益增加。目前，核黃素的生產工藝主要有三種，包括全化學合成法、化學半合成法和微生物發酵法。其中微生物發酵法可分為兩大類：傳統的產核黃素微生物發酵和基因工程微生物發酵。

 

（一）全化學合成法

 

核黃素的全化學合成以D-核糖或D-葡萄糖為起始原料，通過6~9步化學反應合成核黃素，包括氧化、置換、轉位、酸化、內酯化、還原、縮合、偶合和環化。顯而易見，核黃素全化學合成是一個既繁復又耗時的過程（圖2），而且生產成本高、環境污染嚴重。此外，通過該法制備的核黃素產品中通常含有難以消除且具有一定毒性的雜質。因此，全化學合成法逐漸被微生物發酵法所取代。

 

 

圖2. 核黃素的全化學合成途徑。

 

（二）化學半合成法

 

核黃素的化學半合成工藝采用微生物發酵與全化學合成相結合的方式，首先利用微生物發酵將D-葡萄糖轉化為D-核糖，隨后以發酵生產的D-核糖作為主要原料進行核黃素的化學合成。從D-葡萄糖到D-核糖的發酵生產能夠簡化核黃素的合成工藝流程，并降低生產成本，這也是全化學合成法與化學半合成法間的主要區別。然而，由于化學半合成法所用化學添加劑難以去除，導致其在最終產品中的殘留量過高，因此不適合核黃素的大規模生產。

 

（三）微生物發酵法

 

自20世紀中葉起，微生物發酵法便已被應用于核黃素的商業生產，而最初使用的產核黃素微生物主要有三種，包括一種細菌[丙酮丁醇梭菌（Clostridium acetobutylicum）]和兩種真菌[棉阿舒囊霉（Ashbya gossypii）和阿舒假囊酵母（Eremothecium ashbyii）]。然而，由于發酵周期長、產量低，早期的微生物發酵法無法與化學合成法相競爭，因此很難大規模商業化。之后，隨著基因工程技術的發展，用于核黃素生產的基因工程菌被成功構建，如枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）和產氨棒桿菌（Corynebacterium ammoniagenes）。這些細菌能夠有效地將D-葡萄糖轉化為核黃素，從而顯著縮短生產周期，提高核黃素產量。因此，基因工程菌的應用最終促使微生物發酵生產核黃素的商業化變為現實。

 

總體而言，目前微生物發酵法生產核黃素具有生產周期短、原料簡單、產率高、生產成本遠低于全化學合成法和化學半合成法等優點。

 

三、核黃素的微生物合成

 

在真菌、酵母和真細菌等產核黃素微生物中，一分子核黃素的生物合成需要三分子磷酸鳥苷（GTP）和兩分子5-磷酸核酮糖。如圖3所示，作為核黃素生物合成的初始底物之一，GTP（1）在GTP環水解酶II（酶1）所催化的咪唑環開環水解反應中，從核糖基側鏈處水解脫去無機焦磷酸基團，生成2,5-二氨基-6-核糖氨基-4(3H)-嘧啶酮-5'-磷酸（DARPP, 2）。DARPP（2）隨后經還原和脫氨基兩個連續反應被轉化為5-氨基-6-核糖醇氨基-2,4(1H,3H)-嘧啶二酮-5'-磷酸（ArPP, 5），但這兩個反應的先后順序因微生物種類不同而異。在真菌中，DARPP（2）的核糖基側鏈首先在還原酶的催化作用下被還原為核糖醇基側鏈，產生的中間體2,5-二氨基-5-核糖醇氨基-4(3H)-嘧啶酮-5'-磷酸（DArPP, 4）在脫氨酶的作用下進一步脫去氨基，形成ArPP（5）。然而在真細菌中，DARPP（2）則首先在脫氨酶的作用下，脫氨基轉化為中間產物5-氨基-6-核糖氨基-2,4(1H,3H)-嘧啶二酮-5'-磷酸（ARPP, 3），后者繼而在還原酶的作用下，經呋喃核糖基還原開環反應生成ArPP（5）。由此可見，DARPP在細菌和真菌中的還原和脫氨基反應順序是相反的。在隨后的反應中，ArPP（5）在一種非特異性的磷酸酶的作用下進一步脫去磷酸基團，被轉化為5-氨基-6-核糖醇氨基-2,4(1H,3H)-嘧啶二酮（ArP, 6），但該磷酸酶至今尚未明確。近來研究發現，在枯草芽孢桿菌、大腸桿菌和多形擬桿菌（Bacteroides thetaiotaomicron）等菌株中，鹵代酸脫鹵酶（haloacid dehalogenase, HAD）超家族蛋白可以催化ArPP（5）的去磷酸化，與酶4的作用相符。另一方面，5-磷酸核酮糖（7）作為核黃素生物合成的另一初始底物，首先在磷酸丁酮合成酶（酶5）的催化作用下，經分子骨架重排形成3,4-二羥基-2-丁酮-4-磷酸（3,4-dihydroxy-2-butanone-4-phosphate, DHBP, 8）。隨后，在二氧四氫喋啶合酶（或核黃素合酶β-亞基，酶6）的作用下，DHBP與Arp（6）發生縮合反應，生成6,7-二甲基-8-核糖醇基-二氧四氫喋啶（6,7-dimethyl-8-ribityllumazine, DMRL, 9）。作為核黃素合成的直接前體物質，DMRL最終在核黃素合酶（或核黃素合酶α-亞基，酶7）的作用下，經特殊的歧化反應被轉化為核黃素（10）和ArPP（5）。其中，產物ArPP（5）可再次用于另一核黃素分子的生物合成。

 

圖3. 核黃素的生物合成途徑?；衔?是三磷酸鳥苷（GTP）；2是2,5-二氨基-6-核糖氨基-4(3H)-嘧啶酮-5'-磷酸（DARPP）；3是5-氨基-6-核糖氨基-2,4(1H,3H)-嘧啶二酮-5'-磷酸（ARPP）；4是2,5-二氨基-5-核糖醇氨基-4(3H)-嘧啶酮-5'-磷酸（DArPP）；5是5-氨基-6-核糖醇氨基-2,4(1H,3H)-嘧啶二酮-5'-磷酸（ArPP）；6是5-氨基-6-核糖醇氨基-2,4(1H,3H)-嘧啶二酮（ArP）；7是5-磷酸核酮糖；8是3,4-二羥基-2-丁酮-4-磷酸鹽（DHBP）；9是6,7-二甲基-8-核糖醇基-二氧四氫喋啶（DMRL）；10是核黃素。酶 1：GTP環水解酶II；酶 2/酶 3：雙功能核黃素特異性嘧啶脫氨酶/還原酶；酶 4：非特異性磷酸酶；酶 5：DHBP合成酶；酶 6：二氧四氫喋啶合酶或核黃素合酶β-亞基；酶 7：核黃素合酶或核黃素合酶α-亞基。

 

核黃素的微生物發酵合成通常使用真菌和細菌。目前的研究主要集中于兩種類酵母真菌（阿舒假囊酵母和棉阿舒囊霉）以及三種細菌（枯草芽孢桿菌、大腸桿菌和乳酸菌）的應用。對于阿舒假囊酵母和棉阿舒囊霉這兩種真菌，可以通過化學誘變和基因工程的手段實現定向進化，從而調節核黃素的生物合成，實現核黃素產量的提高。然而，改造后的真菌通常發酵周期較長、發酵液黏度高，且需要在含有多種成分的培養基中培養。這些不利因素將增加后期核黃素分離純化的難度，同時提高了生產成本。此外，培養基中還應不斷補充外源物質（不飽和脂肪酸），以提高真菌的生物合成能力。相比之下，使用細菌的優勢更為明顯，例如，發酵周期短、培養基成分簡單，以及可用于細菌的基因工程技術已較為完善。

 

（一）真菌

 

1. 阿舒假囊酵母

 

阿舒假囊酵母（Eremothecium ashbyii, E. ashbyii）是目前用于工業發酵生產核黃素的主要菌株之一，因此其發酵特性也得到了較為全面而詳細的研究。Kalingan和Krishnan證明了不同碳源和氮源及其初始濃度對E. ashbyii NRRL 1363核黃素產量的影響。在此基礎上，一系列針對核黃素工業生產工藝優化的研究相繼開展。Kolonne等報道了pH值對阿舒假囊酵母的胞外核黃素產量的影響。結果表明，在pH值為4.5和5.5時其胞外核黃素產量較高，而在pH值為3.5和8.5時幾乎沒有核黃素合成。Pujari和Chandra通過紫外誘變的方式獲得了一株核黃素高產突變菌株 E. ashbyii DT1，但該菌株產量低、遺傳特性不穩定，限制了其核黃素產量的進一步提升。根據微生物的代謝調控機制，使用具有核黃素及其代謝物類似物抗性的突變菌株，可以降低核黃素生物合成途徑中某些關鍵酶的反饋抑制，進而可能提高核黃素的積累量。然而，阿舒假囊酵母不能在無機鹽培養基中生長，同時也很難找到適合其生長的合成培養基。因此，找到適宜的合成培養基，將提高穩定的核黃素高產阿舒假囊酵母突變菌株的篩選成功率，這些突變菌株的進一步應用將提高核黃素的產量。

 

2. 無名假絲酵母

 

作為一種天然的核黃素高產菌株，無名假絲酵母（Candida famata,C. famata, C. flareri）曾被用于核黃素的工業生產。雖然近年來該酵母已不再被應用于工業化生產，但其在基因工程領域的研究仍在繼續且取得了不少進展。這些研究進展表明，無名假絲酵母具有改造為新型核黃素高產基因工程菌的潛力。

 

Yatsyshyn等以TEF1為啟動子構建了一個攜帶有漢遜德巴利酵母（Debaryomyces hansenii）FAD1基因（編碼FAD合成酶）和FMN1基因（編碼核黃素激酶）的質粒pTFMN1-FAD1，并將該質粒轉入到FMN1基因過表達的重組無名假絲酵母T-OP 13-76之中。在所獲得的重組菌株中，一株命名為C. famata T-FD-FM27的菌株，在最佳條件下分批發酵40 h后生成了451 mg?L-1的黃素腺嘌呤二核苷酸（FAD）。這是關于FAD高產酵母菌株構建的首次報道。

 

在另一項研究中，Dmytruk等以非回復C. famata AF-4菌株為出發菌種，構建了共同過表達SEF1、RIB1和RIB7基因的高產核黃素菌株。利用7 L的實驗室生物反應器進行補料分批發酵實驗，該菌株在優化后的培養基中的核黃素產量達到了16.4 g?L-1，是目前已知的核黃素最高產菌株之一。此外，當將修飾后的PRS3和ADE4基因（分別編碼PRPP合成酶和PRPP酰胺轉移酶，均來源于漢遜德巴利酵母）導入到上述構建的菌株后，其核黃素產量增加了兩倍。

 

3. 棉阿舒囊霉

 

絲狀半子囊菌棉阿舒囊霉最初是從染病的棉花植株（Gossypium sp.）中分離出來的，繼而又被發現是一種天然的核黃素高產菌種。在營養應激條件下，這種真菌的菌絲體會分化形成孢子囊，而孢子在孢子囊內形成的同時，核黃素被合成，其作用可能是保護透明且對紫外線敏感的孢子。經過數十年的菌種改良，1990年基于棉阿舒囊霉（Ashbya gossypii, A. gossypii）的核黃素生物技術合成方法的建立，使核黃素的單位生產率達到了較高的水平，并取代了先前的核黃素多級化學反應合成。棉阿舒囊霉具有天然的核黃素合成能力，其應用于核黃素工業生產已有20多年的歷史。同時，棉阿舒囊霉也具有重要的科學價值，不僅在生物技術領域具有廣闊的潛在應用前景，而且被廣泛地用作真菌發育和進化生物學研究的模式菌種。近年來，棉阿舒囊霉在工業應用和基礎研究方面均取得了豐碩的成果，促進了用于高端基因工程的分子和生物信息學工具的發展，充分發揮了它們的生物技術應用潛力。

 

除了核黃素生產之外，近年來對棉阿舒囊霉在其他生物技術應用方面的研究也取得了重大進展。盡管如此，基于棉阿舒囊霉的核黃素生產工藝優化，以及核黃素高產棉阿舒囊霉菌株的開發，仍是眾多研究人員的主要目標，且當前的研究多集中于分子水平。Schwechheimer等利用13C同位素標記技術對產核黃素真菌A. gossypii B2的碳通量進行了解析。該研究以植物油為原料，采用復雜的工業發酵工藝生產核黃素。根據13C標記數據，甲酸和絲氨酸為一碳供體，可對核黃素的生物合成起到積極影響，而甘氨酸則為唯一的核黃素嘧啶環二碳供體。此外，核黃素合成后期內源甲酸的積累可以克服初期細胞內一碳代謝途徑存在的嚴重瓶頸問題，且少量、分批補充甲酸和絲氨酸可以增強兩者在細胞內的可利用度，使核黃素產量增加45%。隨后，Schwechheimer等首次成功實現了A. gossypii B2菌種在生長階段和核黃素生物合成階段的碳通量定量計算。結果表明，酵母提取物作為常用的工業培養基成分，是菌株生長過程中的主要碳源，對菌株的生長具有顯著影響。然而，菜籽油則為核黃素合成過程中的主要碳源，因此對核黃素生產的影響最大。這些結果突出了碳源對核黃素生產的重要性，需慎重選擇。該研究為A. gossypii B2菌株在復雜的工業發酵條件下的物質代謝帶來了一些全新的認識，對進一步的菌種改良和工藝優化具有重要指導意義。Jeong等利用13C同位素標記技術對野生棉阿舒囊霉（ATCC 10895）及其核黃素高產突變菌株（W122032）的代謝通量進行了分析，并在此基礎上進一步分析了兩個菌種在中心碳代謝途徑上的差異，以期解析棉阿舒囊霉的核黃素過量合成途徑。代謝通量分析結果顯示，突變菌株W122032的磷酸戊糖途徑（pentose phosphate pathway, PPP）-磷酸戊糖合成的代謝通量比野生株高9%，其嘌呤合成途徑（purine synthetic pathway, PSP）-核黃素合成的代謝通量（1.6%）比野生株（0.1%）高16倍。這些結果表明，棉阿舒囊霉突變菌株中由PPP和PSP代謝通量的變化所引起的GTP代謝通量的增加，是其核黃素產量提高的主要原因，這也同時說明增強與PPP和PSP相關基因的表達是提高核黃素產量的一種方案。Silva等以A. gossypii ATCC 10895為出發菌株，利用基因工程技術構建了一株尿苷/尿嘧啶營養缺陷型菌株A. gossypii Agura3，并研究了其嘧啶從頭生物合成途徑（de novo pyrimidine biosynthetic pathway）阻斷所帶來的影響。結果表明，該菌株在常規固體天然培養基上的核黃素產量得到了提高，且尿苷/尿嘧啶的外源添加會抑制核黃素的生成。此外，高濃度的尿嘧啶抑制了該菌株及其出發菌株（A.gossypii ATCC10895）的生長，而過量的尿苷則加速了它們的生長。該研究首次通過實驗探明了棉阿舒囊霉嘧啶生物合成途徑中相關基因的改變對其核黃素產量的影響。

 

作為天然核黃素高產菌種，棉阿舒囊霉菌必須確保較高水平的鳥嘌呤核苷酸途徑（guanine nucleotide pathway）代謝通量，以提高核黃素限制性前體物質GTP的生物可利用度。因此，該真菌核黃素產量的進一步提高需要對其GTP生物合成途徑中關鍵酶的特性有充分的認識。在嘌呤生物合成途徑中，肌苷酸（inosine-5'-monophosphate, IMP）是腺苷酸（AMP）和鳥苷酸（GMP）的共同前體物質，其在肌苷酸脫氫酶（inosine-5'-monophosphate dehydrogenase, IMPDH）的催化作用下被氧化為黃苷酸（xanthosine-5'-monophosphate, XMP），該步反應是一個限速反應。經過一系列連續反應后，XMP最終被轉換成GTP。由此可見，IMPDH是嘌呤生物合成途徑的一個重要的代謝瓶頸。然而，從代謝工程技術角度來看，這種酶的基因改造可操作性高。Buey等對棉阿舒囊霉菌中的IMPDH進行了詳細的功能分析和結構表征。結果表明，當A.gossypii ATCC 10895菌株的IMPDH基因過表達時，鳥嘌呤生物合成途徑的代謝通量增加，最終使該菌株的核黃素產量提高了40%。這項研究極大促進了旨在提高棉阿舒囊霉核黃素產量的代謝工程工具的開發。Ledesma-Amaro等分析了每個rib基因對棉阿舒囊霉核黃素產量的影響，發現當rib基因的轉錄水平和底物GTP的生物可利用度較低時，棉阿舒囊霉的核黃素合成會受到阻礙；而當rib基因（最多5個）共同過表達時，會顯著提高該菌的核黃素產量。研究還發現，編碼腺苷酸琥珀酸合成酶（adenylosuccinate synthase）并調控嘌呤途徑的腺苷酸（adenosine-5'-monophosphate, AMP）分支第一步反應的ADE12基因，其失活或低表達時對核黃素合成具有積極影響。此外，Ledesma-Amaro等還利用代謝工程技術構建了一株過表達所有rib基因并低表達ADE12基因的棉阿舒囊霉菌株A330，該菌株的核黃素產量高達523 mg·L-1，是野生菌株（A.gossypii ATCC 10895）的5.4倍。該研究為工業核黃素產量的增加提供了一種可控且可規?；牟呗?。

 

Park等利用差異誘變技術獲得了一株核黃素高產棉阿舒囊霉突變菌株（W122032）。使用優化后的培養基，該菌株在3L發酵罐中的核黃素產量為13.7 g·L-1，比野生菌株（A.gossypii ATTC 10895）的產量增加了9倍。蛋白質組和DNA微陣列分析結果顯示，參與嘌呤和核黃素生物合成途徑的基因上調，與碳源同化、產能和糖酵解相關途徑的基因下調。這些結果表明，突變菌株核黃素產量的提升與碳代謝通量從β-氧化向核黃素生物合成途徑的轉移有關。

 

（二）細菌

 

核黃素在革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌中的生物合成已有較為詳細的研究，尤其是在枯草芽孢桿菌和大腸桿菌中。在產核黃素細菌中，核黃素的合成由編碼五個基因（ribGBAHT）的核黃素操縱子（rib操縱子）所控制（圖4）。然而，rib操縱子上前四個編碼核黃素合成酶的結構基因的順序與核黃素生物合成途徑中的酶促反應順序（圖3）不同。RibA是第三個rib基因，編碼一種具有GTP環水解酶II和3,4-二羥基磷酸丁酮合成酶活性的雙功能酶。該酶是一種限速酶，其GTP環水解酶II活性可催化核黃素合成的第一步酶促反應。RibG是第一個rib基因，編碼另一種雙功能酶，其核黃素特異性脫氨酶/還原酶活性可依次催化第二和第三步酶促反應。RibH是最后一個rib基因，編碼二氧四氫喋啶合成酶（或核黃素合成酶的β亞基），其催化倒數第二步酶促反應。作為rib操縱子的第二個基因，ribB基因編碼核黃素合成酶的α亞基，催化最后一步酶促反應。此外，rib操縱子還編碼一個功能尚未明確的基因ribT。該基因被注釋編碼了一個假定的N-乙酰轉移酶，且研究表明這個酶的失活雖不會導致核黃素營養缺陷現象，但會顯著降低核黃素的產量。最新的結構研究表明，枯草芽孢桿菌的ribT基因所編碼的酶屬于GCN5（general control nonderepressible-5）相關N-乙酰轉移酶（GCN5-related N-acetyltransferase, GNAT）超家族成員，該超家族的酶能夠催化多種底物的?；磻磳⒁阴］o酶A的乙?；D移到底物上。

 

 

圖4. 細菌rib操縱子的結構。結構基因ribGBAH編碼代謝相關蛋白，轉運基因ribT編碼轉運相關蛋白。細箭頭表示啟動子P1、P2和P3的轉錄方向。此處，RFN指代RFN element，即RFN元件。

 

ribC、ribR和ribO是枯草芽孢桿菌rib操縱子上游存在的三個調控區域，被認為是核黃素生物合成的假定抑制子，因為每個區域發生突變都會導致核黃素的過量合成。其中，ribC和ribR分別編碼一種雙功能黃素激酶/FAD合成酶和單功能黃素激酶，這兩種酶可將核黃素順序轉化為FMN和FAD。RibO是位于ribP1啟動子和ribG基因之間的一個非編碼區，其轉錄產物可以折疊形成一個保守的RNA二級結構，稱為黃素單核苷酸核糖開關（FMN riboswitch）。黃素與FMN核糖開關的相互作用在rib操縱子的轉錄調控中起著關鍵作用。在解離狀態下，FMN因濃度過低而不足以與FMN核糖開關結合形成抗-反終止子結構，從而形成反終止子，以確保后續基因序列的轉錄；然而，在抑制狀態下，FMN與FMN核糖開關結合，形成轉錄終止子從而使轉錄終止。

 

此外，如圖4所示，rib操縱子還含有三個啟動子，包括一個一級啟動子P1（ribP1）和兩個二級啟動子P2和P3（ribP2和ribP3）。ribP1啟動子位于第一結構基因ribG的上游，ribP2啟動子位于ribB的編碼區內，而ribP3啟動子位于ribH和ribT兩個基因之間。四個rib基因（ribGBAH）的轉錄主要由ribP1和位于rib操縱子5'端的調控區控制，最后兩個基因ribA和ribH則由ribP2啟動子和RFN調控區控制轉錄。

 

1. 丙酮丁醇梭菌

 

丙酮丁醇梭菌（Clostridium acetobutylicum, C. acetobutylicum）是一種嚴格厭氧的革蘭氏陽性菌，一個多世紀以來被廣泛用于生物丁醇的發酵生產。這種細菌通常以6∶3∶1的平均質量比合成丁醇、丙酮和乙醇。自20世紀40年代起，除了丁醇高產菌株角色之外，該細菌作為天然核黃素生產菌種的角色也被認可，因為在其丁醇-丙酮-乙醇（butanol-acetone-ethanol, ABE）發酵過程中發現了核黃素的存在。從經濟角度來看，如果核黃素作為第二產物或高附加值副產物的工業產量能夠達到0.5~1.0 g·L-1，ABE發酵工藝的經濟價值則將顯著提高。然而，經過幾十年的研究，丙酮丁醇梭菌ABE發酵過程中的核黃素產量仍提高不足。最近，Zhao等研究發現，在以木糖作為碳源的細菌生長培養基中外源添加乙酸鈉（NaAc），對C. acetobutylicum ATCC 824菌株ABE發酵過程中的核黃素合成具有較強的促進作用。在添加60 mol·L-1 NaAc后，核黃素的生物合成率（ribA通量率）幾乎是對照組的10倍，而核黃素的最終濃度也從最初的無法檢測增加到0.2 g·L-1（0.53 mmol·L-1）。該研究為基于丙酮丁醇梭菌的生物丁醇和核黃素發酵聯產提供了一種新的策略，該策略的實現將提高ABE發酵工藝的商業價值。

 

2. 大腸桿菌

 

作為基礎生物學研究常用的工具菌株，革蘭氏陰性菌大腸桿菌（Escherichia coli, E. coli）的基因組已得到很好的表征，且多種適合其基因編輯的成熟的分子工具也已構建。此外，大腸桿菌因其諸多優勢，長期以來一直被用作各種物質高效合成的常用宿主，如氨基酸、生物燃料以及散裝化學品。例如，大腸桿菌在最佳培養條件下的生長迅速，倍增時間僅為20 min，且其在由廉價原料構成的培養基中也很容易生長?；谶@些極具吸引力的優勢，大腸桿菌也被認為是生產核黃素的潛在高效宿主，然而野生型大腸桿菌在自然條件下無法積累核黃素。因此，一系列針對產核黃素大腸桿菌菌種構建的研究相繼展開，并進行了大量的代謝工程策略的探索工作。

 

目前，幾乎所有的實驗室大腸桿菌菌株均源自于非致病性的K-12或B菌株。盡管這兩種菌株之間在細胞代謝和生理上存在許多差異，但比較基因組分析結果顯示，它們是非常相似且密切相關的。相比于K-12菌株，B菌株在基本培養基中的生長速度更快，重組蛋白的表達水平更高，且乙酸的產量更低。E. coli BL21 (DE3)是一種特殊的工程B菌株，在科學研究和工業生產中的應用最為廣泛。闡明K-12和B菌株在調節機制和代謝方面的差異，將有助于提高它們在代謝工程中的利用率。

 

Wang等首次證明了E. coli BL21 (DE3)在正常培養條件下可以積累核黃素。核黃素生物合成相關酶的序列分析發現，與K-12 MG1655菌株相比，BL21 (DE3)菌株在ribF基因的第115位氨基酸殘基上發生了單一點突變，這個His115Leu突變引起了ribF基因編碼的雙功能核黃素激酶/FMN腺苷酸轉移酶的活性不足，可能是導致核黃素在該菌株中積累的原因。然而，進一步的定量PCR分析顯示，所有核黃素生物合成基因均上調，表明過量的核黃素積累也可能是由某個能上調所有核黃素合成基因的調控機制引起的，而且這個原因似乎更為合理。該研究認為E. coli BL21 (DE3)或許也可應用于核黃素的生產。

 

已有研究表明，枯草芽孢桿菌嘌呤生物合成途徑中的一些關鍵基因的修飾可以增加核黃素前體物質的供應，從而促進核黃素的生物合成。近年來，類似的研究工作也同樣在大腸桿菌中展開。Xu等首先以野生型E. coli MG1655為出發菌種，構建了一株產核黃素的菌株E. coli RF01S，并隨后對該重組菌種的ribB基因和嘌呤途徑的5個關鍵基因（包括ndk、gmk、purA、purF和prs）分別進行了修飾，最終得到了能夠同時過表達所有6個基因的菌株RF18S。該菌株在搖瓶發酵中的核黃素產量為387.6 mg·L-1，核黃素轉化率為44.8 mg·g-1葡萄糖。與RF01S相比，RF18S的核黃素產量和轉化率分別提高了72.2%和55.6%。此研究證明，利用合理的代謝工程技術同時對DHBP合成酶和GTP生物合成途徑進行修飾，是顯著提高大腸桿菌核黃素產量的有效策略。

 

Lin等利用代謝工程技術構建了一個攜帶有核黃素操縱子（由誘導型trc啟動子調控）的質粒p20C-EC10，并將其轉化入野生型E. coli MG1655中，得到的重組菌株RF01S可積累229.1 mg?L-1的核黃素。隨后，將RF01S菌株的pgi（編碼葡萄糖-6-磷酸異構酶）、edd（編碼磷酸葡萄糖酸脫水酶）和eda（編碼多功能2-酮-3-脫氧葡萄糖酸-6-磷酸醛縮酶/2-酮-4-羥基戊二酸醛縮酶/草酰乙酸脫羧酶）基因逐步刪除，并在其acs基因（編碼乙酰輔酶a合成酶）的上游插入trc啟動子，得到重組菌株RF05S，其核黃素產量可達585 mg?L-1。最后，通過調節RF05S菌株中ribF基因（編碼一種雙功能核黃素激酶/FMN腺苷酸轉移酶）的表達，以減少核黃素向FMN的轉化，由此構建的菌株RF05S-M40在37 ℃條件下于LB（Luria-Bertani）培養基中可產生1036 mg?L-1的核黃素。優化發酵條件后，RF05S-M40菌株在最佳條件下通過搖瓶發酵的核黃素產量達到了2703 mg?L-1，比RF01S菌株的核黃素產量高了近12倍，核黃素轉化率為136 mg?g-1葡萄糖。在搖瓶發酵情況下，E. coli RF05S-M40的核黃素產量是所有已報道的產核黃素菌株中最高的。隨后，Lin等所在的實驗室同樣以野生型E. coli MG1655為出發菌種，通過pfka（編碼6-磷酸葡萄糖內酯酶I）、edd和eda基因敲除的方式提高磷酸戊糖（pentose phosphate, PP）途徑的碳代謝通量，由此成功構建了另一種新型產核黃素大腸桿菌菌株LS02T。該菌株所攜帶的核黃素操縱子表達質粒pLS01也是在該研究過程中新構建的，其具有比上述研究中所構建的質粒p20C-EC10更好的穩定性。通過搖瓶發酵，該菌株在含有10 g?L-1葡萄糖的MSY培養基中可產核黃素667 mg?L-1；而在補料分批發酵中，該菌株的核黃素產量達10.4 g?L-1，轉化率為56.8 mg?g-1葡萄糖。該研究首次報道了一種在補料分批發酵中核黃素產量超過10 g?L-1的大腸桿菌工程菌株。上述兩項研究結果表明，大腸桿菌確實是一種潛在的、高效的核黃素生產菌種。

 

3. 枯草芽孢桿菌

 

枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis, B. subtilis）是一種自然普遍存在的細菌，是所有革蘭氏陽性菌中研究最為清楚的菌種之一。它已被歐洲食品安全局（European Food Safety Authority, EFSA）授予了安全資格認定（qualified presumption of safety, QPS），可用于生產動物飼料和人類食品及補充劑，如維生素K2，是安全且穩定的生產菌種。此外，基于核黃素生物合成相關酶在生化、生理和遺傳水平上的詳細研究，枯草芽孢桿菌也被成功改造為核黃素生產的細胞工廠。因此，枯草芽孢桿菌成為利用細菌進行核黃素商業化生產的首選菌種，也是目前最重要的菌種。

 

在過去的20年中，科研人員借助于代謝工程技術進行了大量的枯草芽孢桿菌核黃素產量提高的研究。這些研究大多集中在前體物質的供應和關鍵酶的表達調控上，這兩點也被認為是核黃素合成的主要限制因素。

 

5-磷酸核酮糖（ribulose-5-phosphate, Ru5P）是核黃素的初始前體物質，合成于磷酸戊糖途徑的氧化分支，其合成反應由兩個連續的NADP+-依賴型蛋白酶所催化，即葡萄糖-6-磷酸脫氫酶（glucose-6-phosphate dehydrogenase, G6PD）和6-磷酸葡萄糖酸脫氫酶（6-phosphogluconate dehydrogenase, 6GPD）。然而，這兩種酶的活性會被Ru5P以及其他幾種細胞內代謝物如NADPH和1,6-二磷酸果糖（fructose-1,6-biphosphate, FBP）所抑制。細胞內代謝物的這種變構抑制可導致核黃素合成所需的前體物質供應不足。Wang等克隆了谷氨酸棒桿菌Corynebacterium glutamicum ATCC13032的zwf（編碼G6PD）和gnd（編碼6GPD）基因，并利用定點突變成功消除了這兩個基因的反饋抑制，以期通過基因改造提高Ru5P的利用率。隨后，這兩個突變基被導入到B. subtilis RH33菌株進行單獨表達或共同表達，以量化它們的表達對核黃素合成的影響。結果表明，與親本菌株RH33相比，工程菌株中核黃素生物合成途徑中的代謝產物含量顯著增加，如Ru5P（增加46%）、DMRL、氨基咪唑以及胞內核黃素。在搖瓶發酵中，工程菌株B. subtilis SVZ（zwf基因單獨表達）、工程菌株B. subtilis SVG（gnd基因單獨表達）和工程菌株B. subtilis VGZ（zwf和gnd基因共同表達）的核黃素產量分別增加18%、22%和31%。在進一步的補料分批發酵中，B. subtilis VGZ的核黃素產量平均提高了39%。該研究證明，前體物質供應是枯草芽孢桿菌核黃素合成的主要限制因素，而利用代謝工程技術將碳代謝通量重定向至磷酸戊糖途徑是提高核黃素產量的有效策略。

 

為了增加核黃素生物合成途徑的碳代謝通量水平，Shi等對產核黃素B. subtilis BS77菌株的rib操縱子進行了基因改造，包括ribA基因的過表達，原有啟動子ribP1的取代（替換為來自于B. subtilis 168菌株的強啟動子P43），以及RFN調控區ribO基因的敲除。其中，ribA基因過表達的菌株BS89具有最高的核黃素產量（506 mg?L-1），是菌株BS77（210 mg?L-1）的1.4倍。在此基礎上，一個連續優化方案隨后開展，以解除BS89菌株rib操縱子嘌呤生物合成途徑的反饋調控，包括：①敲除嘌呤操縱子（pur operon）的阻遏蛋白（即PurR，由purR基因編碼）基因及包含有鳥嘌呤感應核糖開關的5'端非翻譯區（5'-untranslated region, 5'-UTR），以消除反饋抑制；②通過定點突變消除PRPP轉氨酶（由purF基因編碼）的產物反饋抑制。這些基因改造成功實現了嘌呤生物合成途徑代謝通量的增加，從而使構建的基因工程菌BS110（發生purF-VQW突變）在搖瓶發酵條件下，獲得最高的核黃素產量（827 mg?L-1）。該研究表明，通過合理地解除嘌呤生物合成途徑的反饋調控，消除轉錄抑制和產物反饋抑制，是提高枯草芽孢桿菌代謝產物產量的一個可行策略。

 

對于合理的、以目標代謝物產量的提高為目的的代謝工程策略的制定來說，對中心碳代謝途徑的深入認識是至關重要的。糖異生（gluconeogenesis, GNG）是指將非糖物質轉化為葡萄糖的生物過程，為中心碳代謝最重要的途徑之一。糖異生途徑的調節已成功地應用于谷氨酸棒桿菌碳代謝通量向磷酸戊糖（PP）途徑的重定向。此外，前人研究表明，糖異生途徑中關鍵酶反饋調控的解除，也是進一步提高核黃素產量的一種可行策略。

 

因此，Wang等以B. subtilis RH33為出發菌株，通過過表達該菌株中三個關鍵的糖異生基因，包括gapB（編碼NADPH依賴型的3-磷酸甘油醛脫氫酶）、pckA（編碼磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶）和fbp（編碼果糖-1,6-二磷酸酶）基因，系統研究了糖異生反饋調控的解除對核黃素產量提高的影響。結果表明，與RH33菌株相比，gapB和fbp基因共同過表達的基因工程菌株在搖瓶發酵中的核黃素產量顯著提高，達到了最高的4.89 g?L-1，核黃素產量提高了21.9%，而其在補料分批發酵中的核黃素產量則提高了27.8%。這項研究說明，解除糖異生途徑的反饋調控是進一步提高枯草芽孢桿菌核黃素產量的有效策略，且該策略也同樣適用于枯草芽孢桿菌中其他直接合成自PP途徑的代謝物，以及合成需要NADPH且以葡萄糖為碳源的物質。

 

Zhang等研究了ribA和ribH基因修飾對枯草芽孢桿菌核黃素產量的影響。結果表明，相比于出發菌株LXZ-1，工程菌LXZ-2由于ribA基因的單獨過表達，核黃素產量提高了99%，搖瓶發酵60 h的核黃素產量為0.47 g?L-1。然而，該工程菌的生物量減少了30%，且由于5-氨基-6-(1-D-核糖醇氨基)尿嘧啶的積累出現了細胞自溶現象。與菌株LXZ-1和LXZ-2相比，基因ribA和ribH在工程菌LXZ-3中共同過表達，使其核黃素產量分別提高了280%和91%，并且未出現生物量下降和細胞自溶的現象。隨后，Zhang等又將一個攜帶有完整rib操縱子的低拷貝數質粒（pMX45）轉化到菌株LXZ-3中，得到菌株LXZ-3/pMX45，并將其用于不同碳源（包括葡萄糖、蔗糖、木糖以及不同比例的木糖和蔗糖混合物）對核黃素合成影響的研究。研究發現，當使用比例為1.5∶6.5的蔗糖和木糖混合物（總糖添加量為8%，w/V）作為碳源時，菌株LXZ-3/pMX45在搖瓶發酵60 h后的核黃素產量最高（1.6 g?L-1）,而在5 L發酵罐中發酵70 h后的核黃素產量最高，為3.6 g?L-1。這項研究表明，蔗糖和木糖的共代謝能夠增加核黃素生物合成前體物質的供應，從而提高核黃素的產量。

 

諾瓦絲菌素（norseothricin, NTC）是一種能抑制蛋白質生物合成的鏈絲菌素類抗生素，廣泛應用于細菌、真菌、酵母和植物細胞的抗性篩選。Cheng等首先利用基因工程技術將sat基因（編碼鏈絲菌素乙酰轉移酶）插入到表達質粒pMA5中，構建了一種新型的、具有NTC抗性的重組質粒pMA5-sat，并隨后將zwf基因（編碼葡萄糖-6-磷酸脫氫酶，G6PD，核黃素生物合成關鍵酶之一）整合至該重組抗性質粒中，得到重組質粒pMA5-sat-zwf。最終，該重組質粒被轉化到產核黃素菌株B. subtilis RF1中，用以研究zwf基因過表達對核黃素合成的影響。結果表明，與原始菌株B. subtilis RF1相比，重組菌株B. subtilis RF1-pMA5-sat-zwf的G6DP活性提高了50倍，說明G6PD成功過表達。該重組菌株在5 L發酵罐中發酵的最終核黃素產量達到12.01 g?L-1，比RF1菌株提高了30.3%。這些結果說明，新構建的NTC抗性質粒pMA5-sat在產核黃素枯草芽孢桿菌的基因改造中具有潛在的應用價值。

 

此外，根據Hemberger等的報道，來源于達窩鏈霉菌（Streptomyces davawensis）的RibM在枯草芽孢桿菌中是一種非能量依賴的功能性核黃素轉運體，主要促進核黃素的外排。將達窩鏈霉菌的ribM基因轉化至一株能夠高效生產核黃素的枯草芽孢桿菌中，獲得的RibM高表達重組菌株的核黃素產量提高，且提高的程度主要取決于誘導劑異丙基-β-D-硫代半乳糖苷（isopropyl β-D-thiogalactoside, IPTG）的用量。這是基于核黃素外排的枯草芽孢桿菌核黃素產量優化的首個成功案例，說明了增加核黃素的外排量也是提高枯草芽孢桿菌核黃素產量的有效策略之一。

 

除了代謝工程方法之外，發酵條件的優化也是一種提高枯草芽孢桿菌核黃素產量的可行方法。

 

培養基的溶解氧是發酵過程中最重要的參數之一，與細胞的生長和產物的合成密切相關。因此，溶解氧的濃度是枯草芽孢桿菌中核黃素合成的一個關鍵因素，其提高可以通過攪拌速度的改變輕易實現。Man等研究了補料分批發酵中攪拌速度對重組工程菌B. subtilis RF1核黃素產量的影響。動力學分析結果顯示，發酵初期較低的攪拌速度（600 r·min-1）可以促進細胞的生長和核黃素的合成，而發酵后期則需要更高的攪拌速度（900 r·min-1）。在此基礎上，Man等制定了一種二段控制策略，即在發酵的前26 h將攪拌速度設置為600 r·min-1，隨后調至900 r·min-1直到發酵結束，以期在整個發酵過程中維持較高的細胞生長速度和核黃素產量。然而，二段控制策略中攪拌速度的突然切換，會在短時間內對細胞的生長和核黃素的合成造成負面影響。因此，Man等隨后建立了一個攪拌速度從600 r·min-1逐漸增加到900 r·min-1的新策略。在該策略下，發酵48 h的核黃素產量達到最高的9.4 g?L-1，轉化率為0.051 g?g-1葡萄糖。與單一攪拌速度（600 r·min-1）下的補料分批發酵的最好結果相比，核黃素的產量和轉化率分別提高了20.5%和21.4%。

 

以尋找合適的核黃素合成促進劑為目的，Wan等以細菌密度（OD600）和核黃素產量為評價指標，研究了7種添加劑的單獨添加對枯草芽孢桿菌在搖瓶發酵中的核黃素產量的影響，包括葡萄糖酸鈣、檸檬酸、檸檬酸鈉、氯化鈣、丙氨酸、蘋果酸和1,6-二磷酸果糖（FDP）。研究結果表明，葡萄糖酸鈣、檸檬酸鈉和丙氨酸的添加對核黃素產量的提升效果最為顯著。因此，這三種添加劑被篩選用于進一步的正交試驗，以研究它們對核黃素合成的綜合影響。結果顯示，當葡萄糖酸鈣、檸檬酸鈉和丙氨酸的最佳濃度比例為7.5 g?L-1、5 g?L-1、1.5 g?L-1時，核黃素產量達到最高的6.46 g?L-1，比無添加劑時提高了大約40%。

 

在最近的一項研究中，Oraei等評價了13種不同礦物質[CaCl2、CuCl2、FeCl3、FeSO4、AlCl3、Na3MoO4、Co(NO3)2、NaCl、KH2PO4、K2HPO4、MgSO4、ZnSO4和MnSO4]對野生型B. subtilis ATCC 6051菌株在搖瓶發酵中核黃素產量的影響，旨在開發合適的發酵培養基以提高核黃素產量。該研究首次采用Plackett-Burman （PB）設計法篩選對核黃素合成有顯著影響的礦物質。結果顯示，MgSO4、K2HPO4和FeSO4三種礦物質的濃度對核黃素合成的影響最大。隨后，采用響應面法（response surface methodology, RSM）進行優化試驗，以確定所篩選出的五種培養基組分的最佳濃度（g?L-1），包括所有試驗中均有使用的兩種碳源（果糖和酵母提取物），以及三種礦物質（MgSO4、K2HPO4和FeSO4）。當這5種組分的濃度分別為38.10 g?L-1、4.37 g?L-1、0.85 g?L-1、2.27 g?L-1和0.02 g?L-1時，搖瓶發酵72 h后的核黃素產量最高（11.73 g?L-1）。

 

4. 乳酸菌

 

乳酸菌（lactic acid bacteria, LAB）是一類不形成孢子的、不呼吸的、通常無運動性的革蘭氏陽性桿菌或球菌，乳酸是其糖類發酵的主要或唯一終產物。該菌種與人類生活密切相關，乳酸菌創造的酸性環境及其產生的抗菌物質如細菌素，能夠抑制發酵食品中許多腐敗菌和致病菌的生長。從古代起，乳酸菌就被經驗性地用作發酵劑，用于加強食品的生物保鮮。如今，乳酸菌在世界范圍內被合理地用作食品工業中的乳酸發酵劑，主要用于各種發酵乳制品（比如酸奶和奶酪）、發酵香腸以及泡菜（發酵蔬菜）的生產。

 

雖然乳酸菌通常為多種維生素營養缺陷型菌株，但目前眾所周知，某些乳酸菌菌種能夠合成一些B族維生素，如葉酸（或維生素B9）、核黃素（或維生素B2）和鈷胺素（維生素B12）。乳酸菌的維生素合成能力在不同的菌株之間的差異相當大，即具有菌種或菌株特異性，這通常與維生素生物合成遺傳信息的（部分或全部）缺失有關。例如，Thakur等利用基于PCR技術的方法對60個乳桿菌中存在核黃素生物合成基因的菌株進行了篩選，并在此基礎上利用微生物實驗從中篩選具有核黃素合成能力的菌株。最終發現，只有14個菌株可以在無核黃素的商業培養基中生長。基于上述結果的進一步綜合分析顯示，在不同種類的乳桿菌中，rib操縱子的存在均具有菌株特異性，而缺失的或不完整的乳酸菌rib操縱子通常與核黃素生產能力的喪失聯系在一起。根據Kleerebezem等和Burgess等先前的報道，植物乳桿菌Lactobacillus plantarum WCFS1菌株攜帶有一個不完整的rib操縱子，其中全部的ribG基因和部分的ribB基因缺失，如預期一樣，該菌株在沒有核黃素的情況下無法生長。然而也有報道稱，植物乳桿菌的一些野生型菌株含有完整的rib操縱子并能產生核黃素，例如，從中國傳統醬菜汁中分離的L. plantarum RYG-GYY-9049菌株，從泡菜中分離的L. plantarum NCDO 1752，以及從天然酸面團中分離的L. plantarum UNIFG1和UNIFG2?？偟膩碚f，乳酸菌rib操縱子的完整性對核黃素的合成至關重要。

 

鑒于其對人類健康的重要性及缺乏癥的普遍性，核黃素成為由乳酸菌生產且被研究得最多的維生素之一。雖然核黃素通常存在于各種各樣的食物中，但由于飲食不均衡，核黃素缺乏癥在世界范圍內的發生率仍然很高。在這樣的背景下，核黃素生物強化食品受到了人們的廣泛關注，因為它們代表了一種更天然、更適合消費者、價格更低的化學合成核黃素的替代品，可以滿足消費者對天然食品日益增長的需求。乳酸菌對食品工業發酵的適應性及其核黃素生產能力，使它們成為生產食品級核黃素的理想候選菌種，為富含核黃素的新型功能食品的開發提供了新的機遇。因此，從各種食物源中篩選野生型產核黃素乳酸菌已引起眾多研究者的興趣。此前有報道稱，其從各種食品中分離得到了179株乳酸菌，然而僅42株菌株能夠在無核黃素的商業培養基中生長。在這些菌株所產的核黃素濃度（高效液相色譜法測定）基礎上，5株具有較高核黃素生產能力的菌株（胞外核黃素濃度為190 ~ 260 ng?mL-1）最終被篩選出并應用于豆奶發酵中，以評估它們在這種食物基質中的生長情況和核黃素合成能力。結果顯示，在37 ℃下發酵12 h后，僅L. plantarum CRL 725菌株產生的核黃素濃度從最初的309 ng?mL-1顯著增加到700 ng?mL-1。在另一項從生羊乳和奶酪中篩選野生型產核黃素乳酸菌的研究中，共179株野生型乳酸菌被分離出，其中僅8株菌株能夠在無核黃素的培養基中生長，產生的核黃素濃度為173 ~ 532 ng?mL-1。

 

然而，在使用從食物或其他來源篩選得到的野生型乳酸菌菌株進行發酵生產時，核黃素的產量和轉化率都相對較低，這是因為某些特定生物活性物質（如核黃素）的最大產率并非它們的自然優化目標。因此，提高這些菌株的核黃素生產能力以實現核黃素的高產仍然是一個挑戰。為了達到這一目標，通常采用的策略有兩種，即具有玫瑰黃色素抗性菌株的篩選以及基于代謝工程的重組菌株的構建。

 

玫瑰黃色素（roseoflavin）是FMN和核黃素的天然毒性類似物，可直接與FMN核糖開關結合，繼而抑制rib操縱子的轉錄。暴露于這種抗菌物質之中可引起產核黃素乳酸菌的自發突變，從而產生核黃素高產菌株。該策略已成功應用于枯草芽孢桿菌、乳酸乳球菌、植物乳桿菌、腸膜明串珠菌（Leuconostoc mesenteroides）和費氏丙酸桿菌（Propionibacterium freudenreichii）等食品級菌株的天然核黃素高產突變體的篩選中，并被證明是切實可行的。

 

P. freudenreichii NIZO B2336是一株篩選自野生型P. freudenreichii NIZO B374菌株的自發抗玫瑰黃色素突變體，其核黃素產量高于原始菌株。當這兩個菌株被用作附屬發酵劑（添加時間為酸奶發酵劑Campina MUH306添加前的24 h）進行酸奶發酵試驗時發現，以P. freudenreichii NIZO B2336菌株為附屬發酵劑生產的酸奶中核黃素的最終含量為19.7 μg?g-1，高于未添加附屬發酵劑的酸奶（12.9 μg?g-1）以及添加了附屬發酵劑P. freudenreichii NIZO B374的酸奶（10.5 μg?g-1）。這項研究證實了P. freudenreichii NIZO B2336菌株可用于富含核黃素的新型發酵乳產品的開發，而新產品則可能會帶來更多的健康效益。

 

如上文中所提到的，Juarez del Valle等篩選了一株具有較高核黃素生產能力的L. plantarum CRL 725菌株，用其發酵豆奶可使核黃素的濃度提高至初始濃度的兩倍。在該菌株的抗玫瑰黃色素突變體的進一步篩選中發現，其中一株突變體（命名為CRL 2130）可使發酵豆奶中核黃素的濃度增至初始濃度的6倍（從309 ng?mL-1到1860 ng?mL-1）。這一研究表明，具有玫瑰黃色素抗性的菌株能夠被用于營養價值更高、富含核黃素的新型大豆制品的開發。

 

此外，Russo等從酸面團中分離出一株野生型的產核黃素發酵乳桿菌（命名為Lactobacillus fermentum PBCC11），并隨后對其抗玫瑰黃色素突變體進行了篩選。結果表明，在所獲得的15株突變體中，7株突變體的核黃素產量超過了1 mg?L-1。其中，核黃素產量最高（1.203 mg·L-1）的一株突變體（命名為L. fermentum PBCC11.5）被進一步用于與商業釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）共接種發酵面包，以增加面包的營養物。與傳統面包相比，如此發酵獲得的面包中的核黃素含量大約增加了兩倍，達到了6.66 μg?g-1，最近，我們成功地從中國傳統醬菜汁中篩選出一株天然核黃素高產植物乳桿菌（命名為Lactobacillus plantarum RYG-YYG-9049），其核黃素產量為0.734 mg?L-1。隨后，我們利用玫瑰黃色素誘導該菌株的自發突變，在所獲得的抗玫瑰黃色素突變體中，第10號突變體（命名為L. plantarum RYG-YYG-9049-M10）的核黃素產量最高。當將該突變體用于豆漿發酵時，在優化的條件下可使發酵豆漿中的核黃素含量達到2.920 mg?L-1。

 

根據先前的報道，玫瑰黃色素誘導的自發突變主要包括rib操縱子上游調控區基因的缺失 和（或）單堿基的改變。然而，我們在最近的研究中發現了一種新的突變類型，即由玫瑰黃色素誘導的、在rib操縱子上游調控區一段大小為1059 bp的DNA片段的插入，該突變可能是引起菌株核黃素產量增加的主要原因。這一發現表明，由玫瑰黃色素介導的突變能夠影響終止子結構的穩定性，減少終止子的形成，從而使rib操縱子能夠持續轉錄，然而其確切的機制仍需進一步的研究。

 

因此，乳酸菌菌種/菌株的合理選擇和發酵條件的優化是提高酸奶、奶酪和面包等發酵食品中核黃素含量的可行策略。新型功能性發酵食品中核黃素含量的提升，既可增加食品本身的營養價值，又可為消費者帶來健康效益。

 

代謝工程技術通常用于核黃素合成能力提高的重組菌株的構建。Burgess等將ribG、ribB、ribA和ribH 4個rib結構基因以不同的組合方式克隆到表達載體pNZ8048中，并隨后將構建的重組表達載體分別轉化到Lactococcus lactis ssp. cremoris NZ9000菌株中，以闡明rib基因過表達對核黃素合成的影響。研究發現，只有攜帶重組質粒pNZBAH的L. lactis NZ9000菌株（共同過表達4個rib基因）的核黃素產量較高（24 mg?L-1）。由此，作為核黃素消耗菌的L. lactis NZ9000被成功轉化為核黃素生產菌。

 

通過暴露于玫瑰黃色素中，Sybesma等從L. lactis NC9000中分離到一株產核黃素的突變體，基因序列分析結果顯示，該突變體L. lactis CB010僅在 rib基因上游調控區內發生了一個堿基的改變。隨后，Sybesma等將編碼氨基-4-羥基-6-羥甲基二氫喋啶焦磷酸激酶和GTP環水解酶I的雙功能酶基因folKE克隆到質粒pZ8161中，得到重組質粒pNZ7017并將其轉化到突變菌株L. lactis CB010中。結果發現，當folKE基因在產核黃素的重組工程菌株（攜帶有質粒pNZ7017的L. lactis CB010）中過表達時，葉酸的產量也同時增加。因此，借助于代謝工程，實現了葉酸和核黃素在乳酸乳球菌中的同時過量合成。

 

作為核黃素和葉酸的共同前體物質，GTP既可以被GTP環水解酶II（由ribA基因編碼）用于核黃素的生物合成，也可以被GTP環水解酶I（由folE基因編碼）用于葉酸的生物合成。因此，這兩種酶之間存在著對GTP分子的競爭，而folE基因的失活可能會提高GTP的供應量，從而促進核黃素的產生。L. fermentum MTCC 8711是一株從酸奶中分離到的野生型產核黃素菌株，其核黃素合成能力在folE基因失活后得到提高。在CDM培養基中發酵24 h后，L. fermentum MTCC 8711菌株的核黃素產量為2.29 mg?L-1，且該產量可穩定維持到72 h，然而folE基因阻斷的菌株L. fermentum GKJFE發酵72 h后的核黃素產量為3.49 mg?L-1，比其親本菌株L. fermentum MTCC 8711提高了約50%。

 

對于微生物發酵生產核黃素而言，代謝工程成為一種利用沒有或只有較低核黃素合成能力菌株的重要且可靠的生物技術。然而，由于消費者或監管機構對基因工程的擔憂，到目前為止，基因工程菌仍不能應用于供人類食用的食品發酵中。

 

四、結論

 

本文綜述了近年來在微生物高產核黃素方面取得的研究進展，主要集中于發酵條件的優化以及源自于化學誘變和代謝工程的核黃素高產菌株的使用。與全化學合成法和化學半合成法相比，微生物發酵法生產核黃素更為經濟、環保。為了取代成本較高的化學合成工藝，近年來開發了許多基于枯草芽孢桿菌和棉阿舒囊霉菌使用的生物技術發酵工藝，其已被應用于工業生產。然而，由于每種微生物都有其優缺點，因此哪種微生物最具優勢且能取代其他微生物，目前尚無定論。盡管細菌的核黃素生產能力較低，但與傳統的核黃素消耗型發酵劑相比，其更適合用作食品發酵的發酵劑。富含核黃素的發酵食品不僅可以提高食品本身的營養價值以及商業價值，還可以消除人們對營養強化的需求。此外，這種新型發酵食品食用將有望降低核黃素缺乏癥的發生率。最后，利用精心挑選的菌株進行核黃素原位生產的理念，為開發面向不同或特定人群（如老年人、兒童、孕婦、運動員、素食者和青少年）的新型食品開辟一條途徑。