摘要

用于傷口的生物材料是一個活躍的研究領域。氧氣在傷口愈合過程的幾乎每個步驟中都起著關鍵作用，在這項研究中，一種產氧光合生物材料被進一步被修飾以釋放其他生物活性分子。海藻酸鹽水凝膠載有光合萊茵衣藻，在光照后可立即釋放氧氣。

此外，光合水凝膠在體外和體內均表現出高生物相容性。在20 名健康人上進行評估，結果顯示該敷料無皮膚刺激，具有機械穩定性，且光合微藻可以正常存活。

該水凝膠還加載了基因工程微藻以釋放人類 VEGF(血管內皮生長因子)，或預加載了抗生素。結果顯示，這兩種生物活性分子皆可持續釋放。

這項工作中的光合水凝膠，可于局部提供氧氣和其他生物活性分子，以加快傷口愈合。

背景

最近，在抗腫瘤治療、中風和缺血治療、器官保存和傷口愈合等多個醫學領域，已經有建議使用光合微生物作為增加局部氧濃度的替代方法。在傷口愈合的情況下，在體外已證明，含有萊茵衣藻微藻細胞的支架可以減少組織缺氧，此外，基因工程制造的微藻和藍藻或可在傷口處提供生物活性分子，如生長因子和糖胺聚糖。本研究團隊開發了一種光合水凝膠傷口敷料，以向傷口釋放氧氣和其他生物活性分子。

研究結果

1、光合水凝膠的制備與表征

按照材料和方法部分(圖1A)所述的方法制備光合水凝膠，形成具有均勻分布的微藻細胞的規則水凝膠網絡(圖1B)。此外，結果表明，結合單層無菌紗布，然后在2% CaCl2中浸泡水凝膠這一步驟，為材料提供了足夠的強度和靈活性，使材料易于進一步操作(圖1B)并具有良好的皮膚附著力。對新生產的光合水凝膠進行了代謝表征，在5?107微藻/ml的條件下顯示出最佳產氧能力。

結果表明，在無光條件下，氧氣的消耗速率為 8.5 ± 2.1 nmol/cm2?min，而在光照條件下，氧氣的產生速率為11.2 ± 2.5 nmol/cm2(圖1C)。在優化步驟中獲得的初步數據顯示，含有最低 (1?107微藻/ml) 和最高 (2.5?108微藻/ml) 微藻密度的水凝膠的氧合能力分別降低了 30% 和 70%。

圖 光合水凝膠制造

 (A) 光合水凝膠是通過將無菌紗布與藻酸鹽、微藻、CaCO3 和 GDL 結合并交聯過夜制備的。接下來，浸入 CaCl2 中以改進材料的處理。(B) 圖片顯示出均勻的成分和柔韌性。(C) 黑暗或光照條件下的氧濃度演變（左）和水凝膠代謝率（右）。

研究了光合作用水凝膠(HG + C. reinhardtii)的結構和力學性能，并與不含微藻(HG)的對照水凝膠進行了比較。掃描電鏡研究了水凝膠的微觀結構，在這兩種條件下都觀察到具有高孔隙率的均勻聚合物排列(圖2A)。SEM圖像也證明了紗布層與聚合物結構融為一體，因為它完全嵌入在水凝膠中，而不影響藻酸鹽交聯模式(圖2A，上圖)。

此外，對照水凝膠的聚合物表面光滑，而光合作用水凝膠的聚合物表面粗糙，表明微藻完全被海藻酸鹽包裹(圖2A，下圖)。定量分析表明，對照水凝膠和光合水凝膠的平均孔徑相近，分別為252.9±8.5 μm和249.1 + 7.8 μm。孔隙分布也得到了類似的結果，但不受藻類存在的影響，兩種水凝膠的孔隙分布范圍在100 ~ 400 μm之間，最大頻率在250 ~ 300 μm之間(圖2B)。

此外，還研究了藻類對水凝膠膨脹能力的潛在影響，評估了它們在鹽水中長達24小時的再水化力度。在對照和光合作用水凝膠之間沒有觀察到差異，在這兩種情況下，都是作用4小時后達到最大膨脹能力，此時重量為其原始時的95%(圖2C)。最后，通過單軸壓縮試驗研究水凝膠對機械力的影響，其中通過應力-應變曲線的線性回歸分析量化壓縮楊氏模量。結果再次表明，微藻的存在不影響水凝膠的楊氏模量，表明光合水凝膠具有與標準藻酸鹽水凝膠相同的機械性能（圖 2D）。

圖 結構和機械特性

 (A) 水凝膠與微藻的成像。(B) HG 與 HG + C.r. 的孔比較。(C)在 30°C 下在 0.9% 的鹽水中膨脹 24 小時的過程中，均為四小時后達到最大膨脹能力。

在7天的光照實驗中，水凝膠持續保持穩定(圖3A，俯視圖)；此外，微藻也并沒有入侵紗布層(圖3A)，結果表明，光合水凝膠的釋氧能力至少保持了7天(圖3C)。

圖 光合水凝膠的穩定性和功能隨時間的變化

(A)水凝膠的光成像(上A)，微藻的完整性和分布(下A)。(B) 葉綠素含量和。(C) 產氧率

2、人體皮膚刺激試驗

三名試驗患者在任何時候都沒有自我感受到疼痛與燒灼感。在 48 和 72 小時后，只有一名志愿者在控制點描述了心悸（圖 5B）。回收應用后的水凝膠進行評估，并沒有發現任何損壞，與應用前的質量相比，水凝膠顯示出 60% 至 70% 的質量損失。

圖 水凝膠在人類志愿者健康皮膚上的應用

(A) 使用時、去除后的0、24、72小時時使用水凝膠與含有微藻的水凝膠的患者前臂圖像 。(B)志愿者在所有時間點完成對不同治療部位疼痛強度(0-10)、瘙癢、灼燒感和心悸感覺(0-3)的自我評估。(C)水凝膠應用后，HG和HG + cr均恢復，以評估完整性(左)和質量減少(右)。(D)將微藻水凝膠鍍于TAP瓊脂中，評估應用后微藻的活力。

3、氧化能力和生物活性分子釋放

將新鮮分離的小鼠皮膚與光合水凝膠放在一起，可發現氧氣含量確實在上升。

圖 光合水凝膠的氧合能力。

(A) 實驗設置示意圖。氧濃度在黑暗(I, DARK)或光明(II, light)中測量5分鐘，同時存在斑馬魚(B,C)或皮膚外植體(D, E)。接下來，加入水凝膠，在有光(III, ON)或無光(IV, OFF)的情況下測量氧濃度10分鐘。

水凝膠因其在原位釋放生物活性分子的能力而被廣泛使用，而轉基因微藻曾被提議作為重組生長因子的局部釋放工具。因此，我們用產生VEGF的微藻制備水凝膠，并在一段時間后測量釋放的重組分子的濃度，結果顯示，在體外至少有7天的持續釋放(圖7A)。

此外，將對照(HG)或光合水凝膠(HG + C. 衣藻)加載頭孢唑林并量化其累積釋放量，各組間數據相似，在前2小時內達到約68%的藥物釋放量，8小時后達到75%，72小時后達到80%(圖7B)。由于微藻可能會潛在地影響藥物的生物活性，因此在對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌進行培養的生長抑制試驗中測定了其抗菌能力。

結果表明，HG和HG + C. reinhardtii在8小時和72小時后釋放的頭孢唑林與新鮮制備的抗生素(對照)一樣有效，而光合作用或對照水凝膠本身沒有抗菌作用(圖7C)。

圖 重組生長因子和抗生素釋放

(A)用轉基因微藻制備的水凝膠在制備0、3和7天后定量釋放VEGF。(B)對照水凝膠或加載了1%頭孢唑林(總8 mg)的光合水凝膠，在0.9%生理鹽水中定量累積釋放長達72小時。

討論

萊茵衣藻是一種在作用于人體時顯示臨床安全性的光合微生物。它還具有強機械性，并可以吸收傷口滲出的液體。本研究中的光合水凝膠還具有持續釋放新產生的重組生長因子和生物活性藥物的能力，如VEGF，這一物質對慢性傷口患者的康復非常重要。這些光合水凝膠展現出的優良特性，還需要進一步研究以評估其在相關臨床前傷口模型（如糖尿病小鼠）和不同類型傷口的人類患者中的療效。

國內也有多個科研團隊在研究功能性傷口凝膠，我們團隊也將會持續關注此領域研究的最新進展。