ADC已成為一類很有前途的抗腫瘤藥物，目前已有十幾種ADC藥物獲得批準，用于治療多種類型的癌癥患者。傳統的 ADC 利用抗體賴氨酸的氨基或打開鏈間二硫鍵獲得的半胱氨酸的巰基進行偶聯，然而其均一性差，穩定性低，影響了藥效及治療窗口。為了改進這些問題，研究人員開發了各種特定部位的定點偶聯方法。這些方法將細胞毒素或化療藥物偶聯到抗體分子中特定的位置，例如半胱氨酸、谷氨酰胺、非天然氨基酸、短肽標簽和多糖，從而制備均一度高，穩定性好，具有更好的活性和藥代學特性的ADC。本文就四大類經典的定點偶聯技術在 ADC 中的應用做一個簡單介紹。

通過特定氨基酸實現位點特異性偶聯

幾種天然或工程改造的氨基酸，包括半胱氨酸和谷氨酰胺，被選作位點特異性的偶聯位點。

THIOMAB技術是第一個對天然氨基酸進行修飾，將未配對的半胱氨酸進行位點特異性的方法。該方法將半胱氨酸殘基插入抗體重鏈(HC)或輕鏈(LC)的不同位置進行偶聯（圖1）。由于工程半胱氨酸在表達過程中易被谷胱甘肽或其他覆蓋，抗體需要部分還原以去除帽子。然后，使用硫醇-馬來酰亞胺化學方法，將未封端的半胱氨酸與含有硫醇連接子進行反應。研究表明通過半胱氨酸殘基(HC-A114C)的藥物連接子偶聯產生的ADC顯示出近乎均一的偶聯物，并且改善了治療指數。例如，抗MUC16 TDC（THIOMAB-drug conjugate）在小鼠卵巢癌移植瘤模型中的體內效果比用傳統半胱氨酸法制備的ADC在同等藥物的劑量下藥效提高了一倍。大鼠和食蟹猴對TDC的耐受劑量也高于常規ADC。

圖1. THIOMAB技術產生的TDC

后續研究者開發了將藥物連接子與抗體特定設計的半胱氨酸進行定點偶聯的ADC。目前，多個位點特異性的ADC已進入臨床，如SGN-CD19B、CD123A和CD352A（均為HC-S239C突變)；RG7861/DSTA4637S(LC-V205C突變)；IMGN632(S442C突變)；BAT8003(A114C突變)；以及基于雙半胱氨酸突變的ADC，如PF-06804103(LC-K183C HC-K290C)。還開發了兩種其他的技術，即半胱氨酸插入，如MEDI2228(HC-i239C)；以及HC-末端多肽融合，如ALT-P7(C-末端ACGHAACGHA融合)。然而，半胱氨酸工程抗體的使用并不能保證臨床成功，一些已經放棄開發，例如，BAT8003和上面提到的Seagen的 三個ADC。

除了通過未配對的半胱氨酸偶聯外，還發展了硫醇橋聯方法。每個雙功能藥物連接子可以捕獲兩個游離的半胱氨酸硫醇基團，從而在所有八個鏈間二硫鍵完全還原后導致DAR4 ADC，異質性較低（圖2）。例如，New Bio 的 NBT828。

圖2. 雙馬來酰亞胺試劑交聯半胱氨酸

谷氨酰胺通過位點特異性偶聯也被報道。該方法不使用還原和氧化試劑，而是利用谷氨酰胺轉氨酶(MTGase)將含胺的藥物連接子或反應性spacer轉移到HC-Q295脫糖抗體中（圖3）。利用該技術的Innate ADC(IPH43)藥物目前處于臨床前階段。

圖3. 利用谷氨酰胺轉氨酶(mTG)將含胺的藥物連接子或反應性spacer轉移到脫糖抗體中

通過非天然氨基酸實現位點特異性偶聯

藥物連接子與抗體中非天然氨基酸的偶聯是另一種新型定點偶聯產生勻質性ADC的方法。目前引入的非天然氨基酸通常為乙酰苯丙氨酸（pAF）、疊氮基甲基-L-苯基丙氨酸(pAMF)和疊氮賴氨酸（圖4）。引入非天然氨基酸的抗體與藥物連接子可定點、定量偶聯，獲得 DAR 均一、藥效高、穩定性好、安全性高的 ADC，但也存在抗體表達困難，易產生免疫原性的弊端。

圖4. 通過非天然氨基酸實現位點特異性ADC

Ambrx 公司的 ARX788 是首個利用非天然氨基酸開發的抗體偶聯藥物，目前處于臨床研究階段。ARX788選擇的非天然氨基酸是乙酰苯丙氨酸（pAF），pAF上的酮基可與有效載荷AS269上的羥胺基團形成肟鍵，發生特異性位點的偶聯，產生均質的ADC。

Sutro Biophma開發了一個無細胞蛋白表達系統，通過特定位置摻入p-疊氮甲基-L-苯丙氨酸(pAMF)，適合于隨后藥物連接子點擊化學的偶聯以此制備ADC。由于無細胞蛋白表達的效率，進行了位點掃描以確定最佳偶聯位置，目前已被用于各種ADC項目。例如， STRO-001（DAR2 ADC，HC-F404的偶聯）、STRO-002（DAR4 ADC， HC-Y180 和 HC-F404 中的偶聯）。

通過糖工程實現位點特異性偶聯

通過將藥物連接子與位于CH2結構域的N297糖鏈偶聯，糖鏈介導的偶聯提供了一種獨特的位點特異性偶聯方法。由于糖鏈的非還原末端存在幾種不同的單糖，人們開發了不同的方法將藥物連接子連接到這些糖上，包括巖藻糖、半乳糖、N-乙酰半乳糖胺(GalNAc)、N-乙酰氨基葡萄糖(GlcNAc)和唾液酸(SA)。

Okeley等人報道了6-硫代果糖（一種巖藻糖類似物）可以通過代謝偶聯到抗CD30或抗CD70抗體中。然后將抗體中的硫代果糖與含有MMAE藥物連接子的馬來酰亞胺偶聯，DAR為1.3。硫代果糖產生的ADC保持了良好的血漿穩定性，并顯示出較強的抗腫瘤活性。

半乳糖或半乳糖類似物也被通過半乳糖基轉移酶引入。菌株促進的環炔與疊氮化物的環加成反應已被用于GlycoConnect，這是Synaffix開發的一項技術，其核心是將疊氮糖以酶促方式引入到天然抗體的多糖上。抗體首先在UDP 6-疊氮基GalNAc存在下經受內切糖苷酶和糖基轉移酶(GalNAc-T) 兩種酶的作用，以便將天然糖轉化為均質的、截斷的和疊氮標記的三糖(圖5)。接下來，對疊氮標記的抗體進行藥物連接子偶聯，以產生均一的ADC。GlycoConnectt技術目前被用于三個臨床ADC藥物：ADCT-601(ADC Therapeutics)、XMT-1592(Mersana Therapeutics)和MRG004A(Miracogen)。

圖5. UDP 6-疊氮基GalNAc存在下用內切糖苷和GalNAc-T進行多糖建模，通過連接有效載荷的無金屬點擊偶聯獲得均一的ADC

此外，也開發了利用唾液酸(SA)進行了位點特異性偶聯的方法。SA首先被轉移到抗體上，然后用高碘酸氧化以連接到含氨氧基的藥物連接子（圖6）。用此方法制備的抗HER2 ADC具有較強的體外和體內抗腫瘤活性。另一種類似的方法是通過無銅點擊化學將C9-疊氮化SA轉移到到抗體上，然后與含有細胞毒素的DBCO偶聯。

圖6. 利用唾液酸(SA)進行的位點特異性偶聯反應

糖工程方法的獨特之處在于，藥物連接子與糖鏈偶聯，而不需要設計氨基酸序列，并且它們連接在遠離氨基酸殘基的地方。然而，該方法需要糖工程所需的特殊試劑和酶。

通過短肽標簽實現位點特異性偶聯

目前開發了一些通過將細胞毒素與含有四到六個氨基酸殘基的特定短肽標簽偶聯的位點特異性偶聯方法。

Strop等人的研究將谷氨酰胺標簽(LLQG)設計成抗體分子，標簽中的谷氨酰胺可以被MTG識別以轉移含胺藥物。該研究證明，藥物連接子MMAD可以通過酶有效地轉移到谷氨酰胺標簽上，包括C端重鏈上的LLQGA或C端輕鏈上的GGLLQGA。該ADC具有均一性的 DAR 2，展現了強效的抗腫瘤活性。

另一項研究通過使用轉肽酶介導的轉肽反應，產生位點特異性偶聯的ADC。轉肽酶的主要功能是幫助蛋白質附著到細菌細胞壁上，并組裝菌毛。轉肽酶作用于含有 C 端細胞壁分選信號的分泌蛋白，該信號含有一個五殘基識別基序，例如 LPXTG，可以與特定的寡甘氨酸受體底物發生酰胺化反應 ，從而用受體的寡甘氨酸片段取代LPXTG的末端甘氨酸。這個方法已經用于產生ADC(圖7)。例如，NBE Therapeutics公司利用這一方法，通過將LPETG標簽融合到重鏈C-末端，然后與五甘氨酸修飾的細胞毒有效載荷PNU-159,682連接，開發了已經進入臨床的ADCs 藥物NBE-002。同樣，GeneQuantum開發了基于重鏈 C 端 LPGTG 的GQ-1001藥物。

圖7. 轉肽酶介導的Gly5-Linker有效載荷與C端LPXTG標記抗體的偶聯

這類方法依賴于將獨特的短肽標簽引入抗體中進行酶修飾。雖然這類方法很簡單，但這些短肽標簽的潛在免疫原性目前尚不清楚，需要后續更多的臨床驗證。

小編小結

通過將細胞毒素或化療藥物與工程特定的氨基酸、非天然氨基酸、短肽標簽和N297多糖偶聯，研究人員開發了下一代位點特異性偶聯技術。這些方法產生的ADC具有高度均一性，保證了生產過程批次間的重現性，與傳統的偶聯物相比具有更高的治療指數。毫無疑問，這些新型技術未來將會為ADC藥物更多的突破和成功發揮重要作用。

參考文獻

1.Site-Specific Antibody Conjugation for ADC and Beyond.

2.Chemical Linkers in Antibody–Drug Conjugates (ADCs).

3.Site-specific conjugation of a cytotoxic drug to an antibody improves the therapeutic index.

4.Site-Specific Antibody−Drug Conjugation through Glycoengineering.

5.Site-specific conjugation of a cytotoxic drug to an antibody improves the therapeutic index.

6.Enzymatic Antibody Modification by Bacterial Transglutaminase.

7.Transglutaminase-Based Chemo-Enzymatic Conjugation Approach Yields Homogeneous Antibody−Drug Conjugates

8.凱萊英藥聞公眾號