遵循檢查清單可以幫助診斷色譜選擇性的變化，這可能是最難分離和校正的色譜柱。

分析系統(tǒng)的選擇性（α）描述了根據(jù)化學(xué)和物理–化學(xué)性質(zhì)的差異來區(qū)分樣品成分的能力。用色譜法術(shù)語，它描述了色譜圖中峰的頂點(diǎn)之間的間隔（圖1），不僅由分析物的性質(zhì)決定，而且由固定相和洗脫液系統(tǒng)的性質(zhì)決定。

通過分析方法獲得的選擇性對于色譜分離至關(guān)重要，并且與峰效率（粗略地是峰寬）結(jié)合使用，將決定色譜圖中峰的分辨率。當(dāng)選擇性變化，分辨率可能降低，使得峰面積測量不夠精確和可重復(fù)的，以及減少在峰識(shí)別或光譜結(jié)構(gòu)鑒定的信心。

選擇性的變化范圍從色譜圖中單個(gè)峰的相對保留的細(xì)微變化到每個(gè)峰的整體保留順序交換，我們需要能夠發(fā)現(xiàn)這些變化并以系統(tǒng)和熟練的方式調(diào)查原因。但是，由于影響選擇性的因素太多，有時(shí)很難知道從哪里開始我們的診斷研究。

圖2顯示了色譜選擇性（峰1和峰2）發(fā)生細(xì)微變化的示例，對于峰的準(zhǔn)確定量存在一定的困難。

從圖2可以看出，選擇性變化還伴隨著向稍后保留的輕微變化，當(dāng)發(fā)生保留變化時(shí)，最好檢查相關(guān)峰的選擇性值以確認(rèn)是否發(fā)生了選擇性變化。在這種情況下，從視覺上看，我們已經(jīng)改變了系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)，因此，我們將繼續(xù)進(jìn)行操作，并調(diào)用選擇性診斷清單來調(diào)查問題。

請務(wù)必注意，檢查清單的順序是“簡單且易行”，例如，檢查清單中較早包含易于檢查的內(nèi)容，以使我們的調(diào)查盡可能高效。

01 檢查方法的梯度曲線

檢查是否已將正確的梯度曲線輸入到色譜數(shù)據(jù)系統(tǒng)（CDS）采集方法中。如果需要，輸入正確的梯度曲線，然后重新分析樣品或標(biāo)準(zhǔn)溶液。

02 確認(rèn)正確的固定相

色譜柱固定相顯然對分離的化學(xué)過程至關(guān)重要，我們的第一個(gè)診斷方法是檢查色譜柱是否正確（包括色譜柱尺寸）。請注意，即使在標(biāo)稱固定相化學(xué)性質(zhì)（例如C18）相同的情況下，在品牌或制造商之間切換時(shí)，發(fā)生選擇性變化也是很常見的。確保僅使用規(guī)定的階段和制造商

對于該方法，除非事先已經(jīng)建立并驗(yàn)證了相位等效性。如果需要，請更改為正確的列，然后重新分析樣品和標(biāo)準(zhǔn)溶液。

03 檢查固定相的批次和批號是否與之前的“良好”分離相對應(yīng)

某些（通常是較舊的或更復(fù)雜的）固定相的選擇性可能在批次或批次之間發(fā)生變化，這是由于制造（鍵合）化學(xué)的細(xì)微或不可控制的變化所致。如果使用不同的色譜柱硬件（管或玻璃料等），選擇性變化也可能發(fā)生。驗(yàn)證批次和批號，如果不同，則從同一批次開始尋找色譜柱，但此時(shí)不要更改色譜柱。

04 驗(yàn)證正確的色譜柱溫度

色譜柱（洗脫液）溫度的變化會(huì)影響分離的選擇性，這在處理離子源分析物時(shí)會(huì)更加明顯（如上述示例中的情況）。確保在CDS中選擇了正確的柱溫箱溫度，并使用熱電阻溫度計(jì)（RTD）在柱加熱器中建立了正確的溫度。有時(shí)有必要調(diào)整所選的柱溫箱溫度以獲得使用RTD測量的正確溫度值。同樣值得注意的是，各個(gè)制造商之間的洗脫液預(yù)熱選項(xiàng)之間的差異。一些系統(tǒng)使洗脫液流過色譜柱隔室金屬織物內(nèi)的小空隙，以將洗脫液預(yù)熱至所需的色譜柱溫度。即使預(yù)熱段液壓路徑的體積差異很小，也會(huì)影響非常敏感的分離的選擇性，因此，應(yīng)牢記高效液相色譜（HPLC）系統(tǒng)制造商之間的差異。確保設(shè)置并達(dá)到正確的色譜柱和洗脫液溫度，然后重新分析樣品或標(biāo)準(zhǔn)溶液。當(dāng)懷疑溫度是造成選擇性差異的原因時(shí)，“最后的選擇”檢查是將分離方法切換為已知可使用所研究方法進(jìn)行良好色譜分離的系統(tǒng)。

05 檢查流動(dòng)相pH

在分析離子源分析物時(shí)，洗脫液的pH值可能會(huì)對分離的選擇性產(chǎn)生很大的影響，在某些情況下，洗脫液pH值的很小變化會(huì)導(dǎo)致較大的選擇性差異。請牢記使用校準(zhǔn)過的pH計(jì)的最佳實(shí)踐方法。確保pH值正確到兩個(gè)小數(shù)位以內(nèi)或至少在方法中指定的小數(shù)位數(shù)以內(nèi)。請記住，當(dāng)使用揮發(fā)性流動(dòng)相添加劑（甲酸，三氟乙酸，氨水等）時(shí)，該添加劑可能會(huì)在長時(shí)間的分析過程中損失掉，因此pH值可能會(huì)隨時(shí)間“蠕變”。嘗試通過指定是否以重量/體積（w / v）或體積/體積（v / v）的方式添加pH調(diào)節(jié)添加劑來避免洗脫液制備中的錯(cuò)誤（例如0.1％的甲酸v / v而不是僅添加0.1％的甲酸） ％甲酸）。重量分析制備洗脫液系統(tǒng)是最好的策略，也是最準(zhǔn)確的。有關(guān)更多信息，請參見參考文獻(xiàn)1.在重新分析之前，檢查并校正與Check 6結(jié)合的pH洗脫液。

06 檢查洗脫液的洗脫強(qiáng)度和緩沖液濃度

確保已使用正確的有機(jī)改性劑溶劑，并在CDS方法中選擇了正確的溶劑通道。在預(yù)混合流動(dòng)相的地方，請確保在混合之前分別測量每個(gè)體積，以避免由于混合潛熱而引起的體積變化或不準(zhǔn)確。當(dāng)使用甲醇作為有機(jī)改性劑時(shí)尤其如此。確保使用了正確的緩沖鹽，pH調(diào)節(jié)劑或添加劑（例如，正磷酸氫二鈉的色譜特性與正磷酸二氫鈉不同），并確保使用了正確重量或體積的添加劑。如前所述，需要檢查添加劑是按體積對體積還是按重量對體積指定。一旦進(jìn)行了這些檢查或準(zhǔn)備了新鮮的洗脫液，請重新分析樣品或標(biāo)準(zhǔn)溶液并檢查選擇性。如果您設(shè)法從與原始色譜柱相同的批次或批號中獲得了HPLC色譜柱，那么現(xiàn)在是嘗試新色譜柱并進(jìn)行評估的好時(shí)機(jī)。

同樣，請注意，任何揮發(fā)性洗脫液添加劑在放置時(shí)都可能蒸發(fā)，這可能會(huì)影響長時(shí)間的分析活動(dòng)或允許將洗脫液靜置在儀器上的批次之間的保留和選擇性。

07 檢查儀器之間的停留體積差異

在梯度HPLC中，洗脫液混合方式的差異（二元泵與四元泵系統(tǒng)），或在洗脫液混合至分析物頂部之間的系統(tǒng)體積之差色譜柱會(huì)導(dǎo)致保留時(shí)間和分離選擇性的差異。為特定方法在HPLC系統(tǒng)之間切換時(shí)，需要驗(yàn)證是否已解決了這些固有的系統(tǒng)差異。這通常是通過在梯度的初始部分添加等度保持，甚至通過引入注入延遲來實(shí)現(xiàn)的，從而在梯度開始后的某個(gè)時(shí)間注入樣品。基礎(chǔ)理論和糾正措施的詳細(xì)信息可以在參考文獻(xiàn)3中找到，但是，此問題比通常認(rèn)為的更為典型，因此，如果已執(zhí)行所有其他清單項(xiàng)目，則將色譜柱和洗脫液系統(tǒng)切換為系統(tǒng)最后一次令人滿意的分離將在其上指示駐留體積差異問題。使用參考文獻(xiàn)3調(diào)整梯度特性并重新分析樣品和標(biāo)準(zhǔn)溶液。

08 驗(yàn)證梯度混合和輸送的準(zhǔn)確性和功能

有時(shí)儀器會(huì)有點(diǎn)破舊，以準(zhǔn)確或可復(fù)制的方式混合梯度的能力會(huì)降低。在這種情況下，嘗試使用其他工具可能是短期內(nèi)最簡單的解決方案。四元泵比二元泵更容易出現(xiàn)梯度混合不準(zhǔn)確的情況，二元泵比基于時(shí)間差流量或活塞沖程量提供正確洗脫液組成的二元泵更容易出現(xiàn)梯度混合不準(zhǔn)確的情況。有多種測試可確定四元混合閥的有效性，但最簡單的方法是在洗脫液（通道B）中加入0.1％v / v丙酮，并在“步驟”中設(shè)定的梯度過程中測量268 nm處的UV響應(yīng)。每段20％”，例如10％B持續(xù)5分鐘，每分鐘10％B直到7分鐘，在20％B保持5分鐘，依此類推。如有必要，請更換混合閥，并注意，有時(shí)由于沉降片和洗脫液容器內(nèi)過濾器的堵塞而引起的氣穴現(xiàn)象可能導(dǎo)致洗脫液混合問題。還應(yīng)按照制造商建議的清潔程序，在必要時(shí)定期清潔這些組件。

有時(shí)，在對通道梯度進(jìn)行編程時(shí)，我們有時(shí)會(huì)有些過于自信，這些梯度僅在幾分鐘甚至幾秒鐘內(nèi)就可以在很大范圍的洗脫液B中上升（可以說，目前正在研究的方法屬于此類）。除非我們使用的是效率最高，死體積最小的泵送系統(tǒng)，否則儀器可能無法準(zhǔn)確或可再現(xiàn)地提供所需的梯度。同樣，對該主題的詳細(xì)處理超出了我們此處討論的范圍。

在我們的示例中，我們遵循清單5，發(fā)現(xiàn)洗脫液制備中存在錯(cuò)誤，該洗脫液是按體積而不是按重量進(jìn)行制備的。量取體積分?jǐn)?shù)為0.01％的甲酸，水溶液的pH值為3.22，而重量法則溶液的pH值為3.27。盡管0.05個(gè)pH單位的差異似乎很小并且沒有意義，但是當(dāng)洗脫液的pH值非常接近目標(biāo)分析物的pKa值時(shí)，這會(huì)導(dǎo)致色譜選擇性的變化。與上次運(yùn)行該方法相比，從新鮮洗脫液中獲得的分離物如圖3所示。此處要說明的另一點(diǎn)是，應(yīng)盡可能在方法上設(shè)計(jì)洗脫液pH距目標(biāo)分析物的pKa值至少1（最好是2）個(gè)pH單位。毫無疑問，開發(fā)此方法的分析人員使用了精細(xì)控制pH值來實(shí)現(xiàn)這種相當(dāng)困難的分離方法，但是，也許更好的方法是使分析物處于完全電離或非電離的形式，并尋求替代的色譜柱，化學(xué)方法和有機(jī)改性劑獲得令人滿意的分離效果。

應(yīng)當(dāng)指出，我們還研究了所用儀器的梯度輸送性能，并且梯度曲線的準(zhǔn)確性和可重復(fù)性令人滿意，因此，這被排除為潛在問題。

總之，色譜選擇性的變化可能是最難診斷和糾正的。應(yīng)該正確地確定選擇性已經(jīng)改變，并且上面概述的診斷清單的實(shí)現(xiàn)代表了一種邏輯且省時(shí)的方法，在該方法中可以隔離并最終糾正分離化學(xué)的問題。在可能的情況下，色譜分離的設(shè)計(jì)應(yīng)考慮到穩(wěn)定性，而在不可能的情況下，應(yīng)仔細(xì)編寫方法說明以突出分離條件內(nèi)的關(guān)鍵變量。