藥品雜質作為影響藥品安全有效性的關鍵因素，在藥品研究、質控過程中發揮了重要作用。本人從事多年的藥物雜質分離純化工作，本文將重點討論藥物雜質對照品的制備獲取方法，包括以下三部分內容：藥物雜質對照品粗品來源；藥物雜質對照品純化分離方法；藥物雜質對照品制備獲得方法。文末將以實例分享制備獲取過程。

1 藥物雜質對照品粗品來源

藥物雜質可以分為工藝雜質、降解雜質、從起始原料或試劑中帶入的雜質等。由于藥物雜質含量往往較低，無論從中間體、反應液或母液提取難度大，獲取成本高，因此快速獲取高含量的雜質粗品尤為關鍵。對于中間體或成品雜質，一般參考合成工藝路線，進行破壞性試驗，例如改變反應物料的配比、反應溫度、后處理方式等。或者參考藥物穩定性影響因素試驗，采用高溫（例如60℃~100℃）、高濕（例如RH90％±5％）、酸堿（例如0.1mol/L-1.0mol/L的鹽酸或氫氧化鈉）、氧化（例如0.1%到3%的過氧化氫）光照等劇烈條件來提高對反應物的破壞降解，提高雜質含量。另外也可以采用定向合成方法，即需要先反推雜質結構，再而設計相關合成路線，待分離純化后，再經液質分析確認。

小結：藥物雜質對照品粗品來源是制備分離的關鍵，雜質含量低，分離難度大，時間成本高。優選定向合成方法，次選破壞性試驗法，以提高雜質含量為目的。特殊情況下，對于某些雜質無法推導其可能結構或者經破壞性試驗雜質含量仍較低者，只能通過富集法。

2藥物雜質對照品純化分離方法

藥物雜質對照品純化分離方法通常包括：結晶法、柱層析法、制備薄層色譜法、制備色譜法和成鹽法、酸堿法等。由于藥物雜質對照品粗品的獲得過程，往往含量較低。因而本文主要討論制備色譜法在分離純化中的應用。

2.1 結晶法

常用的結晶法有冷卻結晶法和反溶劑結晶法。冷卻結晶法是根據物質在某一溶劑不同溫度下溶解度不同，將待純化物加熱至溶解后，降溫析晶的過程。冷卻結晶關鍵在于溶劑的選擇，通常根據“相似相容”原理。而反溶劑結晶法指的是選取兩種溶劑（良性溶劑和不良溶劑），將待純化產物溶于良性溶劑再加入不良溶劑析晶的過程。結晶法主要適用于雜質含量比較高的產品（例如定向合成），本文不做重點討論。

2.2 柱層析法

柱層析法即常說的“過柱子”，分離原理是根據物質在固定相上的吸附能力不同而進行分離，常用的吸附固定相是硅膠和氧化鋁，分離的關鍵在于裝柱方法（濕法和干法），上樣方法（濕法和干法）和洗脫劑的選擇（溶劑選擇和洗脫方式）。柱層析法具有能耗低、洗脫劑易于回收等優點，同時也存在分離過程費時、效率低，對于復雜化合物純化效果差等缺點。

2.3 制備薄層色譜法

制備薄層色譜法（爬大板法）可以快速分離反應體系混合物的多種成分，是一種實用快速獲取少量對照品的方法。制備薄層色譜法操作流程主要包括：硅膠板的選擇（通常自制、厚度好）、樣品上樣、洗脫展開、色帶檢測、刮板溶解。制備薄層色譜法雖然操作方便，設備簡單，但仍存在樣品處理量小的缺點。

2.4 制備液相色譜法

制備液相色譜法是一種具有高靈敏度、高選擇性的快速分離技術，其目的是對產品進行快速分離純化。在純度、收率、分離效率等方面遠優于傳統的制備方法，已廣泛地應用于藥物研究的分離和純化。

2.4.1制備液相色譜和分析液相色譜的比較

制備液相色譜法分為正相制備色譜和反相制備色譜兩種。其中反相制備色譜使用廣泛，固定相一般采用反相填料（C18、C8）等，藥物的分離純化多采用以C18為填料的反相色譜柱。與分析液相用于對樣品進行定量和定性不同，制備液相的目的是對特定組分進行分離和純化，不需要很高的精密度和準確度。

2.4.2制備液相色譜的進樣操作

制備液相為了提高制備量，經常采用超載進樣。超載方式有兩種，一種是“濃度超載”，即待純化物質溶解于較小的進樣體積，提高進樣濃度；另一種是“體積超載”，即將待純化物質溶解于較大量的進樣體積，減少進樣濃度。濃度超載和體積超載都將導致化合物分離度的降低。樣品在流動相中具有足夠溶解度情況下，優選濃度超載法。通過建立合適的制備方法分離化合物峰，經過檢測器時被檢測到并收集起來，進而通過蒸發或冷凍干燥除去流動相而得到純品。

2.4.3制備液相色譜方法的建立和注意事項

2.4.3.1了解待純化樣品的相關物性

了解雜質粗品的來源，通過定向合成、破壞降解或母液濃縮富集，初步了解其中可能含有的化合物。利用液質聯用技術，檢測分析樣品的分子量和分離情況。對于經酸堿破壞降解的雜質粗品液，可以通過比較不同時間段，放置于不同環境溫度，考察目標雜質含量變化情況，了解雜質的酸堿穩定性，熱穩定性，為后期去除流動相提供基礎理論。

2.4.3.2 待純化樣品的預處理

雜質樣品往往來源復雜，含有不可逆吸附作用物質，一方面容易堵塞污染柱子，另一方面降低柱使用壽命，影響重現性。因而，必要的前處理如萃取、過濾、析晶、等分離方法尤為重要。另外，關注分離體系是否含有重金屬類物質，樣品溶液進樣是否需要調節Ph等。

2.4.3.3 建立初步制備分離方法

根據目標化合物結構，推測其極性大小，采用等度或梯度洗脫方法摸索保留時間。關注待分離目標化合物與其前后雜質的分離度，而不要求在分析柱上得到所有組分的基線分離。流動相中水相調節劑常加入：甲酸、乙酸、甲酸銨、乙酸銨等，有機相常使用乙腈和甲醇。制備分離方法的初步建立，在于摸索從分析方法到制備方法的區別，需要確保所有雜質全部洗脫。

2.4.3.4 制備方法的優化

優化方向的目的：回收率和純度。建立了初始的制備方法后，確定了目標雜質峰的位置以及整個洗脫體系的情況后，為了節約時間和成本，我們只關注目標雜質和相鄰雜質的分離情況，而經常采取濃度超載或體積超載進樣。制備中常常因為超載而無法使目的物與鄰近雜質間達到完全基線分離，可以優化出峰時間，采用分段收集的方法得到指定純度的目的物。對于體系復雜者，可以二次制備純化。

3藥物雜質對照品制備獲得方法

對于定向合成方法，往往能得到較高含量的目標雜質，這種情況下，通常采用萃取法或結晶法，減壓濃縮除去溶劑或過濾洗滌烘干，即可得目標雜質對照品。需要注意的是，雜質對照品往往不穩定，盡量快速低溫制備烘干，最后保存于低溫冰箱。通過柱層析法或制備薄層色譜法分離的雜質，通常也是低溫快速減壓濃縮至干，低溫冰箱保存。而對于含量較低的雜質粗品而言，通過制備液相色譜法得到的制備液。對于弱極性物質，可以先減壓去除乙腈，再萃取濃縮至干；對于水溶性強的物質，可以采用不含鹽的水相-有機相再次制備除去緩沖鹽，最后采取低溫旋除水或冷凍干燥法去除水，即可得到目標雜質。

實例分享：含有β-內酰胺類抗生素開環物的制備獲取過程

開環物雜質溶液獲取方法

根據文獻，可知β-內酰胺是指一類含有四元內酰胺環的有機結構，在酸堿條件下容易開環。因而優選酸-堿破壞法（0.1mol/L-1.0mol/L鹽酸或氫氧化鈉水溶液），調整物料比和反應時間（減少副產物例如聚合物的產生）即可得含量較高的雜質溶液；

開環物雜質溶液的純化分離方法

得到開環物雜質溶液后，需要調節反應液Ph至中性左右，以終止反應。因而體系中引入了無機鹽和其他可能雜質。開環物含有羧基和仲氨基，易溶于水。純化分離優選反相制備色譜，一方面可以出去可溶性鹽，另一方面可以進一步提高純度。

反相制備色譜方法的建立

以分析液相（4.6*250mm-5μm）為例，可檢測目標雜質的極性和相鄰雜質情況，制備方法的建立以21.2*250mm-5μm制備柱為例，流動相以純化水和乙腈為例，以平行放大原理，

其中，V2、r2、L2分別為制備色譜的流量、內徑、柱長；V1、r1、L1分別為分析色譜的流量、內徑、柱長；建立初始方法，然后超載進樣，優化方法，收集制備液，經液相分析，純度滿足后，連續進樣，得到不含鹽的水相制備液。

水相制備液的后處理

得到符合純度要求的水相制備液后，通常先低溫旋除有機溶劑，然后依據雜質穩定性，選擇低溫濃縮至干或冷凍干燥，即得雜質對照品。最后低溫冰箱密封保存。

總結：藥物雜質對照品在質量研究中不可或缺。然而由于含量低，獲取難等原因，目前市場上雜質對照品價格昂貴，增大藥企研發成本。制備液相色譜在純化分離有著顯著的優勢。