雜質的來源分析

 

對藥物雜質研究時引入“質量源于設計( Quality byDesign，QbD)”的理念，可在藥物生產之前根據具體工藝的合成機制、起始物料及各中間體的基本結構，初步勾畫出產品的雜質譜。

 

雜質來源分析是制定藥物雜質控制策略的基礎，尤其是在對毒性雜質來源分析時，應分析所有合成和生產工藝中的試劑、中間體、副產物，推測可能產生的潛在雜質以及分析實際存在的雜質。在原料藥合成結束后，藥物的活性化合物雖然經過毒性分析已不含有“警示結構”(alerting structure)，但是在生產過程中使用到含有警示結構的化合物則還需考慮其遺傳毒性。

 

 

1、雜質的分類和存在的問題

 

任何影響藥物純度的物質統稱為雜質。在藥物研發中雜質的研究貫穿其整個階段，是保證藥品質量的重要內容。藥品中的雜質分類通常有四種方法：

①按理化性質分類：有機雜質、無機雜質及殘留溶劑。

 

②按來源分類：工藝雜質( 包括合成中未反應完全的反應物及試劑、中間體、副產物等)、降解產物、從反應物及試劑中混入的雜質等。

 

③按毒性分類：毒性雜質和普通雜質等。

 

④按化學結構分類：其它甾體、其它生物堿、幾何異構體、光學異構體和聚合物等。雜質的存在對藥物的安全性和有效性有很大的影響，如何制定雜質的限度也是藥物研發過程中一個非常敏感的問題。目前國內在藥物雜質研究中存在的主要問題是“雜質限度制訂的依據不充分”。研制單位通常是根據多批樣品的研究結果確定，或憑所謂的“經驗”制訂。特別是方法學研究不全面，沒有對雜質進行有效地分析，并進行定性研究，導致雜質研究不完善，成品與國外產品的質量差別較大。

 

2、一般要求

 

藥品的開發需遵循三個原則：安全、有效和質量可控。因此，在制訂質量標準中雜質的限度時，首先應從安全性和有效性方面考慮，尤其對具有藥理活性或毒性的雜質，要嚴格控制其限度。其次，應考慮生產的可行性及批與批之間的正常波動，以及藥物本身的穩定性。在保證安全和有效的前提下，根據工藝的波動情況制定合理的限度。此外，在藥物研發過程中不同藥物或者同一藥物在不同研究階段的側重點是不一樣的。因此，其雜質研究也各具特點，需要根據這些具體情況分別對待。

 

通常，可以根據藥物規定的劑量確定降解產物的報告閾值、鑒定閾值和界定閾值，以此來確定雜質的限度。另外，亦可通過已知雜質的毒性數據，或其毒性研究結果來確定雜質的限度。

 

（1） ICH 的一般要求

在確定了藥物的劑量后，可以根據降解產物的閾值來制訂雜質的限度。此時，可參照ICH( 人用藥品注冊技術要求國際協調會) 的相關要求制訂雜質限度。

 

如，按ICH 要求，對于新的原料藥，每日最大劑量大于2 g 時，單個雜質的界定閾值為0.05％ ；每日最大劑量不大于2 g 時雜質的界定閾值0.1％或1 mg( 按嚴格的要求定)。當一個原料藥的每日最大劑量為1.5 g 時，如按界定閾值0.1％計，則雜質的絕對攝入量為1.5 g×0.1％ =1.5 mg，大于界定閾值1 mg ；

 

如按閾值1 mg 計，則雜質的限度值為1 mg÷1.5 g×100％ =0.07％，與界定閾值(0.1％ )不一致。在這種情況下，制訂雜質限度的原則是“按嚴格的要求定”，即雜質限度應訂為0.07％。

 

當然ICH 只是一般的要求，對于特殊雜質( 具有一定活性) 或雜質限度超出ICH 的要求時，應進行相關的安全性研究或根據文獻數據，以判斷限度的合理性。

 

（2） 已知雜質化合物的毒性數據

對于已知雜質化合物，可參考相關的文獻，或一些數據庫( 如www.discoveryGate.com 網站) 查得其毒性數據，并根據藥品臨床擬用的劑量推算藥物的安全限度。

 

比如，雜質苯肼的臨床主要毒性反應為急性血管內出血，內臟器官損害包括肝、腎、心、骨髓和中樞神經系統等的多發性損害，高濃度還可引起肺組織損害；即使作為苯肼衍生物，也具有潛在的致癌性風險。文獻[3] 顯示，雄性鵪鶉靜注苯肼0.6、6、60 mg/kg，給藥后24 h 和72 h 均產生明顯的溶血反應，并伴有淋巴細胞增多、單核細胞減少和嗜酸性細胞減少。因此，對于某些藥物中的苯肼雜質，應進行必要的控制。人體試驗或用藥中的苯肼總量

 

應不高于0.05 mg/kg。若人體最大用藥劑量為2 g時，產品中如含有該雜質，按人體重60 kg 計，其限度值為0.05 mg/kg×60 kg÷2 g×100％ =0.15％。

 

（3）根據安全性的研究結果推算

對于沒有安全性數據的雜質，需要進行安全性試驗，然后根據雜質的NOAEL( 未觀察到毒性反應的劑量水平，no adverse effect level) 數據進行推算。

 

一般情況可采用以下方法：

 

①對單個雜質進行毒理學研究，確定其NOAEL，制訂該雜質的限度如，某創新藥臨床前試驗樣品中雜質A 的限度為0.34％，每天的最大用量擬定為10 mg。其臨床研究用藥，申報單位將雜質A 限度確定為0.5％。這一限度不但超過了ICH Q3 規定的常規雜質限量標準( 0.1％ )，也超過了臨床前試驗樣品中雜質A0.34％的限度。因此，在該品種的審評中，藥審中心建議提供該雜質限度確定的依據。

 

研究者對此進行了說明，其推算過程如下：該藥在大鼠重復給藥6 個月的毒性試驗中，無毒性反應劑量為26.5 mg·kg-1·d-1，則雜質A 的實際用量為26.5×0.34％ =0.09 mg·kg-1·d-1。通過動物類比法轉換為0.09 mg·kg-1·d-1×6=0.54 mg·/m-2·d-1( 大鼠在人體中mg/kg 劑量的轉換因子為6)，再用FDA 轉換標準( 人體中mg/kg 與mg/m2 的轉換因子為37)，得出相當于60 kg 的人體耐受雜質A 的量為0.54×60÷37=0.88 mg/d。

 

考慮到該新藥在臨床研究中的最大給藥劑量為10 mg，若按0.5％的雜質含量計算，每日的雜質A 最大劑量為0.05 mg/d，僅為雜質A無毒性反應劑量0.88 mg/d 的1/17，因此雜質A 的限度訂為0.5％是可行的。

 

②根據毒理學實驗樣品雜質含量情況進行推算，制訂出雜質的限度如，某個藥物口服給藥的每日最大劑量為60mg，相當于一個體重60 kg 的人給藥劑量為1mg/kg。在13 周犬的口服給藥毒理學研究中，確定其NOAEL 為2 mg/kg。

 

根據該批樣品中雜質A 的含量為0.1％計算，雜質A 最大安全性限度為2 mg/kg×0.1％ =2 μg/kg，換算到人體的雜質A 安全劑量約為1μg/kg( 犬在人體中mg/kg 劑量的轉換因子為1.8)，則雜質A 的限度為1 μg/kg÷1 mg/kg×100％=0.1％。

 

以上方法只是一個參考，研究者可根據研究結果綜合考慮，選擇合理的方法，制定科學、合理的雜質限度，當然不同類別的藥物雜質限度的研究有所不同。

 

分析方法 

 

分析方法的選擇直接關系到雜質測定結果的專屬性與準確性，因此，在進行雜質研究時首要問題是選擇合適的雜質分析方法。

 

1、分析方法的選擇 

 

（1）有機雜質的分析方法 

 

有機雜質的檢測方法包括化學法、光譜法、色譜法等，因藥物結構及降解產物的不同采用不同的檢測方法。通過合適的分析技術將不同結構的雜質進行分離、檢測，從而達到對雜質的有效控制。隨著分離、檢測技術的發展與更新，高效、快速的分離技術與靈敏、穩定、準確、適用的檢測手段相結合，幾乎所有的有機雜質均能在合適的條件下得到很好的分離與檢測。

 

在質量標準中，目前普遍采用的雜質檢測方法主要為高效液相色譜法（High Performance Liquid Chromatography；HPLC）、薄層色譜法(Thin Layer Chromatography；TLC)、氣相色譜法(Gas Chromatography；GC)和毛細管電泳法（Capillary Electrophoresis；CE）。應根據藥物及雜質的理化性質、化學結構、雜質的控制要求等確定適宜的檢測方法。

 

由于各種分析方法均具有一定的局限性，因此在進行雜質分析時，應注意不同原理的分析方法間的相互補充與驗證，如HPLC與TLC及HPLC與CE的互相補充，反相HPLC系統與正相HPLC系統的相互補充，HPLC不同檢測器檢測結果的相互補充等。 

 

（2）無機雜質的分析方法 

 

無機雜質的產生主要與生產工藝過程有關。由于許多無機雜質直接影響藥品的穩定性，并可反映生產工藝本身的情況，了解藥品中無機雜質的情況對評價藥品生產工藝的狀況有重要意義。對于無機雜質，各國藥典都收載了經典、簡便而又行之有效的檢測方法。

 

對于成熟生產工藝的仿制，可根據實際情況，采用藥典收載的方法進行質量考察及控制。對于采用新生產工藝生產的新藥，鼓勵采用離子色譜法及電感耦合等離子發射光譜－質譜（ICP-MS）等分析技術，對產品中可能存在的各類無機雜質進行定性、定量分析，以便對其生產工藝進行合理評價，并為制定合理的質量標準提供依據。 

 

通常情況下，不揮發性無機雜質采用熾灼殘渣法進行檢測。某些金屬陽離子雜質（銀、鉛、汞、銅、鎘、鉍、銻、錫、砷、鋅、鈷與鎳等）籠統地用重金屬限度檢查法進行控制。

 

因在藥品生產中遇到鉛的機會較多，且鉛易積蓄中毒，故作為重金屬的代表，以鉛的限量表示重金屬限度。如需對某種（些）特定金屬離子或上述方法不能檢測到的金屬離子作限度要求，可采用專屬性較強的原子吸收分光光度法或具有一定專屬性的經典比色法（如采用藥典已收載的鐵鹽、銨鹽、硒等的檢查法檢測藥品中微量鐵鹽、銨鹽和硒等雜質）。

 

雖然重金屬檢查法可同時檢測砷，但因其毒性大，且易帶入產品中，故需采用靈敏度高、專屬性強的砷鹽檢查法進行專項考察和控制，各國藥典收載的方法已歷經多年驗證，行之有效，應加以引用。 

 

由于硫酸根離子、氯離子、硫離子等多來源于生產中所用的干燥劑、催化劑或pH調節劑等，考察其在產品中的殘留量，可反映產品純度，故應采用藥典中的經典方法進行檢測。如生產中用到劇毒物（如氰化物等），須采用藥典方法檢測可能引入產品中的痕量殘留物。 

 

對于藥典尚未收載的無機雜質（如磷酸鹽、亞磷酸鹽、鋁離子、鉻離子等）的檢測，可根據其理化特性，采用具有一定專屬性、靈敏度等的方法，如離子色譜法、原子吸收分光光度法、比色法等。 

 

2、分析方法的驗證 

 

雜質檢測方法的驗證應參照相關的技術指導原則進行，重點在于專屬性和靈敏度的驗證。專屬性系指在其它成分可能共存的情況下，采用的方法能準確測定出被測雜質的特性。檢測限是反映分析方法靈敏度的一個重要指標，所用分析方法的檢測限一定要符合質量標準中對雜質限度的要求，最低檢測限不得大于該雜質的報告限度。 

 

為驗證雜質分析方法的專屬性，對于原料藥，可根據其合成工藝，采用各步反應的中間體（尤其是后幾步反應的中間體）、立體異構體、粗品、重結晶母液等作為測試品進行系統適用性研究，考察產品中各雜質峰及主成分峰相互間的分離度是否符合要求，從而驗證方法對工藝雜質的分離能力。 

 

為了考察方法能否有效檢測出原料藥或制劑中的降解產物，還可根據藥物的化學結構特點、制劑的處方與工藝、儲存條件等選用合適的酸、堿、光、熱、氧化反應等加速破壞性試驗來驗證分析方法的專屬性，必要時可采用二極管陣列檢測器、質譜檢測器等檢測峰的純度。

 

因為在強制降解試驗條件下產生的降解產物較藥品貨架期產生的降解產物復雜、未知雜質多，分離難度大，上述分析方法可有效地顯示各色譜峰的純度，以免因分離度不符合要求，導致分析結果的不準確。

 

如不具備檢測峰純度的試驗條件，可通過適當調整流動相的組成或比例使各色譜峰的相對保留時間發生改變，用同一份經加速破壞試驗的供試品溶液進樣，然后比較流動相調整前后雜質峰的個數；也可采用TLC法比較同一份經加速破壞試驗的供試品溶液在不同展開系統下的斑點個數及位置，以此佐證雜質分析方法的專屬性。 

 

強制降解試驗對于未知雜質的分離度考察是非常必要的，其目的主要是提供關于雜質（特別是降解物）與主成分的分離情況、樣品穩定性及降解途徑等重要信息。在試驗過程中，應注意破壞性試驗要適度，應著重考察敏感條件。

 

如產品在一定條件下穩定，則無必要再提高條件的劇烈程度進行重復試驗。破壞試驗的程度暫無統一要求，一般以強力破壞后主成分的含量仍占絕大部分為宜。此時已產生了一定量的降解產物，與樣品長期放置的降解情況相似，考察此情況下的分離度更具有實際意義。

 

要達到這種破壞程度，需要在研究過程中進行摸索，先通過初步試驗了解樣品對光、熱、濕、酸、堿、氧化條件的基本穩定情況，然后進一步調整破壞性試驗條件（如光照強度、酸堿濃度、破壞的時間、溫度等），以得到能充分反映降解產物與主成分分離的結果和圖譜。

 

另外，通過比較試驗前后主峰面積的變化，還可粗略估算降解物對主成分的相對響應因子，了解樣品在各種條件下的穩定性，為包裝及貯藏條件的選擇等提供信息。對于性質相對穩定的藥品，如有充分的文獻依據或試驗數據，則可以免做強制降解試驗。 

 

3、有機雜質的定量方法 

 

有機雜質的檢測一般多采用HPLC法，有時也采用TLC、GC等其它方法。

 

如采用HPLC法，須采用峰面積法，具體定量方法有

 

①外標法（雜質對照品法）、

 

②加校正因子的主成分自身對照法、

 

③不加校正因子的主成分自身對照法、

 

④峰面積歸一化法。

 

①法定量比較準確，采用時應對對照品進行評估和確認，并制訂質量要求。

 

②法應對校正因子進行嚴格測定，僅適用于已知雜質的控制。

 

③法的前提是假定雜質與主成分的響應因子基本相同。一般情況下，如雜質與主成分的分子結構相似，其響應因子差別不會太大。

 

④法簡便快捷，但因各雜質與主成分響應因子不一定相同、雜質量與主成分量不一定在同一線性范圍內、儀器對微量雜質和常量主成分的積分精度及準確度不相同等因素，所以在質量標準中采用有一定的局限性。 

 

有關物質中包括已知雜質和未知雜質。已知雜質對主成分的相對響應因子在0.9-1.1范圍內時，可以用主成分的自身對照法計算含量，超出0.9-1.1范圍時，宜用雜質對照品法計算含量，也可用加校正因子的主成分自身對照法。理想的定量方法為已知雜質對照品法與未知雜質不加校正因子的主成分自身對照法兩者的結合。研究人員可根據實際情況選用合適的定量方法。 

 

在選擇合適的分析方法時還應考慮生產能力及質量控制的可行性等技術因素。盡管在附件中規定的限度精確到小數點后第二位，但并不意味著在日常的生產質控中所用的分析方法也要如此精確。如經過必要的驗證，也可采用薄層色譜法等分析方法。在研發過程中，如果分析方法有改變，則應進行方法改變前后所得分析結果的可比性研究。 

 

對于TLC法，通常采用雜質對照品法和主成分自身對照法進行檢控制，后者僅限于雜質斑點的顏色與主成分斑點顏色一致的情況下使用。