摘要：報告基因法是目前發展的熱原檢測新方法，具有操作簡單、快速，不使用動物、檢測熱原譜廣，可對熱原進行定量等優點，已越來越廣泛地應用于生物制品熱原檢測。2021年10月《體外熱原檢查法(報告基因法)》在中國藥典委網站公示，為更好地理解該公示稿內容，推動該方法的實施，本文以HL60­pNL3.2報告基因熱原檢查法為例，介紹該公示稿框架和內容，對報告基因法在生物制品中的應用進行了展望，以期為準確應用該方法控制相關產品的質量提供參考。

關鍵詞：體外熱原檢查法；報告基因法；家兔熱原檢查法；細菌內毒素檢查法；單核細胞活化反應測定法

Abstract: Reporter gene assay is a new pyrogen test developed at present. It has some advantages such as simple and fast operation, animal free, wide pyrogen spectrum and quantitation and so on, and has been more and more widely used in pyrogen detection of biological products.In vitro pyrogen test (reporter gene assay) was published for consultation on the website of the Chinese Pharmacopoeia Committee in October 2021. In order to better understand its content and promote its implementation, taking HL60pNL3.2 reporter gene assay as an example, this paper introduces the framework and content of the draft, prospects the application of the method in biological products, and provides the reference for the accurate application of the method to the quality control of related products.

Key words: in vitro pyrogen test; reporter gene assay; rabbit pyrogen test; bacterial endotoxin test; monocyte activation test

熱原是保障非腸道用藥，特別是靜脈注射用藥安全性的重要檢查項目之一[1]。傳統的檢測方法有家兔法和內毒素檢測法，兩種方法雖是熱原檢測的經典方法，但均存在一定的局限性[2]。基于熱原引起人體發熱機理而設計的單核細胞活化反應測定法，具有不使用動物、檢測熱原譜廣，可對熱原進行定量等優點[3]，該方法雖已收載于歐洲藥典(EP 10.0版)、英國藥典(BP 2021)和中國藥典(ChP 2020)，但檢測周期較長，實驗操作較繁瑣，因此需發展新的熱原檢測方法。

隨著生物技術的發展，報告基因法因快速、靈敏、操作簡便已越來越廣泛地應用于生物技術藥物質量分析[4]。近年來，對于報告基因方法在熱原檢測中的研究報道也越來越多[4-­7]，但報告基因熱原檢查法目前未見收載于歐洲藥典、英國藥典、美國藥典和日本藥局方JP等各國藥典。中國食品藥品檢定研究院與上海市食品藥品檢驗研究院通過研究建立基于不同穩轉細胞的報告基因熱原方法，共同草擬了公示稿草案，經復核單位復核，藥典委員會專家討論后，2021年10月《體外熱原檢查法(報告基因法)》在中國藥典委網站公示，該公示稿不僅統一規范報告基因熱原檢查法，而且體現中國藥典標準的先進性和創新性。為更好地理解該公示稿內容，推動該方法的實施，本文以本實驗室建立的HL60­pNL3.2報告基因熱原檢查法為例，簡介了該公示稿框架和內容，對報告基因法在生物制品熱原測定中的應用進行了展望，以期為準確應用該方法控制相關產品的質量提供參考。

1  公示稿框架

《體外熱原檢查法(報告基因法)》公示稿參照《中華人民共和國藥典》(簡稱《中國藥典》)2020年版通則9301注射劑安全性檢查法應用指導原則項下“單核細胞活化反應測定法”體例擬定。該公示稿未規定具體的轉基因細胞系，適用于所有使用報告基因技術對熱原進行測定的方法，從方法的原理和適用性、實驗材料、熱原污染物限值的確定、溶液的配制、供試品干擾試驗、測定法和結果判斷八個方面對體外熱原檢查法(報告基因法)進行了規范。公示稿前言介紹了方法的原理和適用性；實驗材料對實驗所用的轉基因細胞株、試劑和材料提出明確要求；熱原污染物限值的確定、確定最大有效稀釋倍數、溶液的配制、供試品干擾試驗和結果判斷均參照《中國藥典》2020年版“單核細胞活化反應法”內容擬定；測定法未規定具體的實驗參數，僅介紹了方法的大致流程，同時為保障實驗結果準確可靠，提出了系統適應用性要求。

2  公示稿內容淺談

2.1  方法原理和適用性

了解熱原作用機理是建立體外熱原檢查法(報告基因法)的前提。文獻報告[8, 9]，熱原進入人體后，作用單核細胞上Toll樣受體(TLR)，通過相關信號(如NF­κB)通路刺激細胞分泌致炎因子，引起人體發熱。根據熱原作用機理，構建TLR表達豐富、含熱原活化標志物(如NF­κB)和熒光素酶報告基因質粒的穩轉細胞株，熱原刺激穩轉細胞株后，由熒光素酶表達量和熱原濃度之間的量效關系，可對供試品熱原進行定量檢測。

NF­κB是細胞內重要的轉錄因子，也是目前構建適用于熱原檢測的穩轉細胞株常用的熱原活化標志物，不僅在炎癥反應，而且在免疫調控、應激反應和細胞凋亡中均起重要的作用[10­-12]，因此，NF­κB信號通路的激活并非熱原特異性作用的結果?；谠摲椒ǖ奶攸c，公示稿明確該方法不適用于本身能刺激或抑制熱原標志物(如NF­κB)活化的供試品。在實驗操作中，若發現供試品刺激穩轉細胞株后，有熒光素酶報告基因的表達，需用內毒素檢查法或家兔法進一步進行熱原污染確認。

本實驗室前期建立了HL60­IL6單核細胞激活測定法[13-­15]，發現人白血病HL60細胞表面Toll樣受體2，4，6(TLR2，4和6)均表達豐富，NF­κB信號通路在HL60細胞受熱原刺激后分泌致炎因子中扮演重要的作用。根據該作用機制，本實驗室將帶有NF­κB和熒光素酶報告基因的質粒轉染入HL60細胞中，構建了HL60­pNL3.2穩轉細胞株，并研究建立了基于HL60­pNL3.2細胞的體外熱原檢查法(報告基因法)。

2.2  實驗材料

因體外熱原檢查法(報告基因法)使用的試劑、包括細胞培養液、基礎培養液、顯色劑等均和穩轉細胞株有關，公示稿未明確具體的穩轉細胞株，規定“根據轉基因細胞及建立并驗證的方法選擇適宜的細胞培養液、維持培養液和顯色劑”。本公示稿規定“轉基因細胞的構建應符合中國藥典《基于基因修飾細胞系的生物檢定法指導原則》(擬增)和《生物制品生產檢定用動物細胞基質制備及質量控制》的要求”，為適用于熱原檢測的穩轉細胞株的檢定明確了方向。同時參照EP10.0版2.6.30  Monocyte­ activation­test對單核細胞系的要求，對穩轉細胞株功能性、穩定性提出要求。參照《中國藥典》2020年版單核細胞激活測定法內容，本公示稿規定該方法所用的所有耗材均須無熱原污染，即所用的商品化的試劑需注明無熱原，所用的耗材均需進行去熱原處理，公示稿同時列舉了常用的去熱原方法。

參考《中國藥典》關于生物制品生產檢定用動物細胞基質制備及檢定規程和EP10.0版2.6.30 Monocyte ­Activation Test(單核細胞活化反應測定法)要求，本實驗室對HL60­pNL3.2穩轉細胞株功能性、無菌、支原體、外源病毒污染、TLR表達，細胞生長曲線及細胞功能穩定性等進行研究，結果待發表。

2.3  干擾實驗

參照《中國藥典》2020年版“單核細胞活化反應法”擬定干擾實驗內容。規定供試品必須對實驗無干擾才可以用該實驗進行熱原測定。在實際操作中，需計算供試品最大稀釋倍數，在最大稀釋倍數內，考察供試品對熱原檢查是否存在干擾。當回收率在50%～200%之間，則認為在此試驗條件下供試品溶液不存在干擾作用。當回收率不在指定的范圍內，須排除干擾因素，并重復干擾試驗來驗證處理的有效性。當首次應用本法進行供試品熱原檢測時，一般需對3個批號以上的供試品進行干擾實驗。參照《中國藥典》通則1143“細菌內毒素檢查法”，公示稿規定：當供試品的處方、生產工藝改變或試驗環境中發生了任何有可能影響試驗結果的變化時，須重新進行供試品的干擾試驗。

2.4  測定法和結果判斷

測定法因細胞系不同而異，該公示稿未明確具體的轉基因細胞系，提出“因不同轉基因細胞測定法的試驗參數不同，應在試驗前建立測定法并加以驗證。”參照《中國藥典》和EP單核細胞活化反應測定法內容，規定至少測定三個稀釋度供試品熱原含量，且三個稀釋度供試品熱原含量均小于規定的限值(CLC)，則供試品符合規定。系統適用性是判斷試驗結果是否有效的重要標準，為保證實驗結果的準確可靠，參照EP和《中國藥典》單核細胞活化反應測定法和報告基因法的特點，本公示稿擬定了系統適用性標準。

本實驗室通過探討HL60­pNL3.2穩轉細胞株不同接種密度、熱原作用細胞不同時間，培養液中不同胎牛血清濃度(FBS)對試驗結果的影響，確定了關鍵實驗參數，根據以上參數建立了基于HL60­pNL3.2細胞的體外熱原檢查法(報告基因法)[16]。參照《中國藥典》2020年版分析方法驗證指導原則對該方法進行線性、準確度、精密度等指標驗證。參照EP 10.0版2.6.30 Monocyte­Activation Test(單核細胞活化反應測定法)cut­off值計算方式，將陰性測定信號的平均值加3SD作為Y值，代入擬合曲線中，計算相應的熱原濃度(X值)，即為該方法檢測相應熱原的檢測限。在該方法研究建立的過程中，發現每次實驗所得內毒素(LPS)四參數標準曲線及陰性對照OD值均不相同，故每次獨立實驗所得cutoff值和檢測限均不同。而檢測限又是進行供試品熱原檢測時，計算供試品最大稀釋倍數最為關鍵的因素，檢測限不同將影響供試品最大稀釋倍數的計算，從而導致實驗結果的誤判。本實驗室通過試驗，確定該方法檢測限為0.05 EU·mL-1，在本實驗室按0.05 EU·mL-1計算最大稀釋倍數。對于不同實驗室，建議每次實驗時設立陰性對照，并計算每次實驗的cut­off值及檢測限，若cut­off值低于可定量范圍，則將進行四參數標準曲線擬合的最低熱原濃度點作為方法檢測限，確定方法的檢測限后，再計算樣品最大稀釋倍數。

3  報告基因熱原測定方法在生物制品中的應用

目前關于報告基因法在熱原檢測中的應用文獻報告較多。2017年，Palma[7]在單核細胞系MM6中轉染了含NF­κB報告基因的質粒，建立了一種新的報告基因熱原檢測方法。2018年，中國科學研究院的kaili Li[6]在人腺癌肺泡基底上皮A549細胞中轉染入含NF­κB報告基因的質粒，構建了適用于熱原測定的穩轉細胞株。2019年，中國生物制品檢定研究院賀慶[5]在RAW264.7細胞中轉染入含NF­κB報告基因，建立了基于RAW264.7細胞的報告基因熱原測定方法。

本實驗室探討了HL60­pNL3.2報告基因熱原檢查法在托珠單抗、雷珠單抗和阿達木單抗等13種單抗制品，水痘疫苗、狂犬疫苗、三價流感疫苗和四價流感病毒裂解疫苗4種疫苗制品，人血白蛋白、靜注人免疫球蛋白、Ⅷ因子3種血液制品熱原測定中的應用，發現在最大稀釋倍數范圍內，除1種單抗制品外，熱原在其他19種生物制品中的回收率均在50%～200%之間，HL60pNL3.2報告基因熱原檢查法可用于該19種生物制品熱原測定。其中對熱原存在干擾的1種單抗制品，在最大稀釋倍數內，熱原回收率低于 50%(n=3)，表明該方法不適用于該單抗熱原檢測，存在干擾的原因需進一步探討研究。

4  結語與展望

基于我國現階段的實際情況，并控制體外熱原檢查法(報告基因法)的初期應用風險，該公示稿僅將體外熱原檢查法(報告基因法)作為熱原檢查的補充方法，未強制該方法的執行。

隨著生物技術的快速發展，新型生物制品如細胞制品不斷獲批上市。2021年，兩款CAR­T(Chimeric Antigen Receptor T­Cell)細胞治療產品在國內獲批上市，為淋巴瘤患者帶來福音，同時熱原檢測對保證該類細胞制品安全性至關重要。因細胞制品生產工藝特殊、生產經過病毒轉導，體外擴增，最終回輸入血等一系列過程，涉及環境復雜，僅對其進行內毒素控制，無法保證產品的安全性，而家兔法需要供試品量大，實驗成本高，供試品本身可能引起家兔體溫升高，對實驗結果存在干擾。而且該類產品有效期短，病人需求急，需快速放行，體外熱原檢查法(報告基因法)適合該類制品的熱原檢測。另外，腺病毒載體疫苗、核酸疫苗和基因治療制品都是目前研究的熱點，體外熱原檢查法(報告基因法)在該類制品熱原檢查中具有良好的應用前景。

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