在旺盛的需求下，mRNA技術(shù)有望進入快速發(fā)展的黃金十年。

 

導讀：mRNA（信使核糖核酸）技術(shù)作為一種極具潛力的通用技術(shù)平臺，可以用于傳染病的預防、腫瘤免疫治療、蛋白替代、CAR-T、基因編輯等，總體可以分為三大類：預防疫苗、治療醫(yī)療、治療藥物。輝瑞/BioNTech合作開發(fā)的Comirnaty和Moderna開發(fā)的Spikevax，2020年12月相繼獲得FDA緊急使用授權(quán)用于預防由嚴重急性呼吸綜合征冠狀病毒2 (SARS-CoV-2) 引起的COVID-19。2021年Comirnaty和Spikevax的銷售額分別達到了368億美元和177億美元，兩款疫苗在全球防疫中大放異彩，這也預示著mRNA技術(shù)正式進入商業(yè)化時代。我國的mRNA技術(shù)行業(yè)也開始蓬勃發(fā)展，目前石藥、康希諾針對突變株的mRNA疫苗今年4月份已獲批臨床。下面我們來盤點一下mRNA疫苗研發(fā)的技術(shù)壁壘和市場前景。

 

mRNA由DNA模板轉(zhuǎn)錄而來，攜帶遺傳信息，指導細胞生產(chǎn)胞內(nèi)蛋白、膜蛋白及胞外蛋白。以mRNA疫苗為例，核心原理就是將編碼的mRNA通過不同的方式遞送到人體細胞內(nèi)，在細胞內(nèi)翻譯后產(chǎn)生相應的抗原蛋白，從而有效激起細胞免疫和體液免疫。遞送的mRNA通過內(nèi)吞作用進入細胞，并在體內(nèi)釋放后，通過核糖體翻譯成蛋白質(zhì)。

 

翻譯的蛋白質(zhì)可以通過兩種方式激活免疫系統(tǒng)：蛋白質(zhì)被蛋白酶降解為肽，隨后通過主要相容性復合物MHC I類分子與T細胞受體（TCR）結(jié)合作為抗原呈遞在細胞表面，通過激活CD8+ T細胞，它可以通過分泌細胞因子來激活細胞免疫反應，也可以通過共激活B細胞來激活體液免疫反應。此外，在mRNA疫苗中遞送的單鏈RNA和雙鏈RNA通過與體內(nèi)的Toll樣受體（TLR）結(jié)合，產(chǎn)生I型干擾素（IFN-I）導致了幾種IFN-1刺激基因的誘導，激活抗病毒先天免疫反應。

 

圖1 mRNA疫苗的作用機理

 

 

A、mRNA技術(shù)的發(fā)展歷程

 

分子修飾、遞送等關(guān)鍵技術(shù)實現(xiàn)突破，為商業(yè)化時代開啟奠定了基礎。mRNA從首次發(fā)現(xiàn)到作為商品銷售大概經(jīng)歷了60年，技術(shù)的發(fā)展經(jīng)歷了以下幾個階段。

 

（1）1961-1990年：mRNA從理論照進現(xiàn)實。從1961年mRNA的發(fā)現(xiàn)，到1990年全球首次發(fā)表小鼠體內(nèi)體外轉(zhuǎn)錄mRNA的報告，明確了mRNA的具體機制和作用以及其發(fā)展?jié)摿Α?/span>

 

（2）1990-2009年：分子修飾等關(guān)鍵技術(shù)使得人體應用成為可能。從上世紀90年代到2009年，mRNA技術(shù)實現(xiàn)了從動物到人體的突破，2005年發(fā)現(xiàn)化學修飾可降低mRNA免疫原性，2009年首次在人體上應用癌癥免疫治療。

 

（3）2009-2022年：遞送技術(shù)的發(fā)展推動人體臨床大規(guī)模開展。2009年脂質(zhì)納米顆粒（LNP）遞送系統(tǒng)首次申請專利，2010年全球mRNA領導者Moderna成立。2015年首個LNP遞送技術(shù)以及序列修飾技術(shù)的逐漸成熟，給mRNA行業(yè)發(fā)展帶來充足的動力，多項mRNA疫苗開展臨床。

 

（4）2020年-至今：商業(yè)化時代正式開啟，2020年全球首個mRNA商業(yè)化產(chǎn)品上市，迅速得到資本市場的追捧。

 

B、mRNA疫苗的生產(chǎn)過程和成本構(gòu)成

 

mRNA疫苗的生產(chǎn)主要包括靶抗原序列設計、質(zhì)粒構(gòu)建、建立三級細菌生物庫，DNA模板制備、mRNA的體外轉(zhuǎn)錄、mRNA的純化、LNP組裝和封裝、mRNA-LNP復合物稀釋、mRNA-LNP復合物濃縮、無菌過濾和罐裝等，生產(chǎn)過程涉及到分子結(jié)構(gòu)設計、遞送系統(tǒng)的優(yōu)化，生產(chǎn)工藝放大等諸多環(huán)節(jié)，每個環(huán)節(jié)都有一些技術(shù)壁壘或者工藝難點需要解決，由于mRNA分子的脆弱性，目前尚未完全實現(xiàn)裸露mRNA藥物注射進人體從而發(fā)揮作用，因此找到合適的遞送系統(tǒng)便成為最關(guān)鍵的部分。另外，找到合適的遞送系統(tǒng)后，讓mRNA的翻譯效率最高則需要序列優(yōu)化，同時摸索將實驗室中試工藝放大并穩(wěn)定生產(chǎn)需要的工藝參數(shù)，從而形成穩(wěn)定的供貨體系。

 

圖2 mRNA疫苗的生產(chǎn)過程

 

已上市的兩款mRNA新冠疫苗，單劑售價大約在15-20美元左右（不同地區(qū)可能會有差異），毛利率85%左右，則生產(chǎn)成本大約在1-3美元。其中原材料占比（41.7%-55.9%）最高，其次是設備/耗材（23.9%-31.7%）。在原材料中，帽子類似物占比46%，工具酶（包括T7 RNA聚合酶、無機焦磷酸酶、RNA抑制酶）占比29%、核苷酸/修飾核苷酸占比7%、DNA模板占比4%、LNP四種組分占比5%，其他原材料占比10%。

 

表1 mRNA疫苗生產(chǎn)成本拆分（億美元，8億劑）

來源：中泰證券

 

C、mRNA疫苗研發(fā)關(guān)鍵壁壘：遞送系統(tǒng)、序列優(yōu)化、生產(chǎn)工藝

 

?遞送系統(tǒng)：專利保護和工藝參數(shù)鑄就遞送系統(tǒng)的高壁壘

 

mRNA的脆弱性使得遞送系統(tǒng)成為關(guān)鍵。mRNA指導細胞生產(chǎn)自身所需蛋白質(zhì)，靶點可在細胞內(nèi)或分泌到細胞外，因此理論上可將編碼相應蛋白質(zhì)的mRNA通過一定手段運送到細胞質(zhì)內(nèi)，從而對所有蛋白質(zhì)層面疾病發(fā)揮療效。但是由于其大小、電荷和可降解性，裸露的mRNA不容易穿過細胞膜并有效滲入到細胞質(zhì)，因此如何將mRNA遞送至細胞質(zhì)中并及時指導蛋白質(zhì)生產(chǎn)將成為核心。

 

目前mRNA遞送主要面臨3個難點，如胞外屏障、內(nèi)體逃逸、包內(nèi)免疫，一個優(yōu)異的遞送系統(tǒng)需要解決以上3個難點。目前已有脂質(zhì)/類脂、聚合物、多肽、蛋白質(zhì)、胞外囊泡等材料用于遞送系統(tǒng)，其中脂質(zhì)/類脂、聚合物最為常見。進入臨床的遞送系統(tǒng)主要有脂質(zhì)體、LNP、脂質(zhì)復合物、脂質(zhì)多聚復合物（LPP）,其中LNP最為常見。目前Monerna、BioNTech、CureVac以及國內(nèi)除斯微生物的多數(shù)mRNA公司的遞送系統(tǒng)均使用LNP。

 

LNP主要是由陽離子脂質(zhì)、中性脂質(zhì)、PEG修飾脂質(zhì)、膽固醇等構(gòu)成，不同分子及構(gòu)成比例是各種LNP系統(tǒng)的主要差異所在。

 

陽離子脂質(zhì)：具有pH敏感性，與帶負電的mRNA結(jié)合，可高效包載核酸藥物，同時在酸性環(huán)境下被質(zhì)子化，有助于內(nèi)涵體逃逸。

 

中性脂質(zhì)：穩(wěn)定粒子，破壞內(nèi)涵體穩(wěn)定性提高核酸遞送效率。

 

PEG修飾脂質(zhì)：提高粒子穩(wěn)定性，減少粒子在體內(nèi)與血漿蛋白的結(jié)合，延長體循環(huán)時間。

 

膽固醇：穩(wěn)定LNP結(jié)構(gòu)，調(diào)節(jié)膜流動性，提高粒子穩(wěn)定性。

 

圖3 LNP結(jié)構(gòu)示意圖

 

表2 不同公司LNP組分構(gòu)成

來源：中泰證券

 

盡管BioNTech和Moderna的mRNA疫苗都使用了LNP遞送系統(tǒng)，但是兩家公司或多或少都面臨著專利糾紛。目前Arbutus具有LNP遞送系統(tǒng)的專利所有權(quán)（US8058069B2），其專利范圍包含核酸、陽離子脂質(zhì)，非陽離子脂質(zhì)、綴合脂質(zhì)以及各成分的比例，專利預期2029年到期。

 

表3 LNP遞送系統(tǒng)的專利范圍

來源：中泰證券

 

雖然LNP遞送系統(tǒng)的組分配方已經(jīng)公開，但是大量的工藝參數(shù)依然是商業(yè)秘密，這也意味著即使企業(yè)知道如何使用合適比例的原料進行LNP的配制，LNP粒徑是否均一，雜質(zhì)是否有殘留、陽離子脂質(zhì)導致的細胞毒性、LNP的靶向性以及如何可控的釋放包封藥物等也會影響工藝參數(shù)的穩(wěn)定性。

 

?序列優(yōu)化：分子修飾專利和高效率加帽構(gòu)成較大難度

 

mRNA的基因序列一般由5’-cap（5’端帽子）、5‘UTR（5’端非編碼區(qū)）、ORF（編碼區(qū)）、3’UTR（3‘端非編碼區(qū)）以及Poly（A）tail（多聚腺苷酸尾）組成。通過對mRNA分子序列優(yōu)化，提高mRNA分子穩(wěn)定性、翻譯效率、表達量、半衰期等，從而進一步增加mRNA疫苗的安全性和有效性。2021年6月CureVac宣布其開發(fā)的mRNA疫苗CVnCoV在2b/3期臨床試驗中預防感染COVID-19僅有47%的保護力，可能失敗的原因包括未對編碼區(qū)的核苷酸進行修飾。

 

圖4 mRNA的結(jié)構(gòu)和核苷酸修飾

 

5’-cap（5’端帽子）：在真核生物中可以與翻譯起始因子elF4E結(jié)合，保持mRNA的穩(wěn)定，提高翻譯效率，同時抑制外切核酸酶對mRNA的降解并抑制固有免疫反應。

 

5‘UTR（5’端非編碼區(qū)）：調(diào)控翻譯和蛋白表達，對mRNA的翻譯效率、半衰期、蛋白表達水平等有影響。一般可以引入Kozak序列或者保持短散的設計從而增強翻譯效率。

 

ORF（編碼區(qū)）：3個堿基組成的密碼子可以翻譯成氨基酸，之后形成肽鏈后結(jié)構(gòu)化成蛋白質(zhì)。通過密碼子的優(yōu)化（規(guī)避不常見/不安全組合）、核苷酸替換（使用假尿嘧啶、5-甲基胞嘧啶、N6-甲基腺苷等修飾核苷酸）等增強mRNA的穩(wěn)定性和翻譯效率、同時減少固有免疫和mRNA的降解。

 

3’UTR（3‘端非編碼區(qū)）：調(diào)控翻譯和蛋白表達，對mRNA的翻譯效率、半衰期、蛋白表達水平等有影響。一般可以引入穩(wěn)定元件（人類α-珠蛋白/β-珠蛋白）來增強mRNA穩(wěn)定性、增強翻譯效率。

 

Poly（A）tail(多聚腺苷酸尾)：抑制mRNA脫帽和降解，尾巴長度影響翻譯效率和蛋白表達水平。一般而言，64-150 nt長度的Poly（A）能夠?qū)崿F(xiàn)最高水平的蛋白表達。加尾途徑一般有兩種：模板加入Poly（A），轉(zhuǎn)錄后Poly（A）修飾。

 

已經(jīng)上市的兩款mRNA疫苗均對mRNA的分子序列、結(jié)構(gòu)等進行了設計和優(yōu)化。分子修飾的關(guān)鍵專利（US8278036B2）所有權(quán)屬于賓大，預計2025年到期，通過兩次授權(quán)給BioNTech和Moderna，該專利范圍極廣，包括（a）假尿嘧啶、（b）Poly(A)尾、(c)m7GpppG帽/3’-O-甲基-m7GpppG帽、（d）不依賴帽的翻譯增強子、（e）增強翻譯的5’和3’非翻譯區(qū)，其中假尿苷修飾最為關(guān)鍵。目前該專利基本上都繞不開，需要購買該專利或者開發(fā)更為合適的分子修飾策略，但難度極大。在不考慮專利壁壘的情況下，體外轉(zhuǎn)錄合成mRNA分子最關(guān)鍵的環(huán)節(jié)在于如何高效率加帽。加帽途徑一般有兩種：一步法（共轉(zhuǎn)錄加帽）、兩步法（轉(zhuǎn)錄后加帽）。其中BioNTech用到的就是共轉(zhuǎn)錄加帽，Moderna利用的則是轉(zhuǎn)錄后加帽。

 

表4 兩種加帽途徑的對比

來源：中泰證券

 

?生產(chǎn)工藝：將mRNA更好地搭載到遞送載體上是關(guān)鍵

 

在mRNA疫苗的生產(chǎn)過程中，將含有脂質(zhì)的乙醇相和含有mRNA的水相混合后形成脂質(zhì)超飽和狀態(tài)，在毫秒級時間里自組裝成納米顆粒。最關(guān)鍵的工藝環(huán)節(jié)是將mRNA包裹在LNP中，從而形成穩(wěn)定的納米顆粒。目前可通過微流控、射流等方式實現(xiàn)這一過程，然而各家公司的工藝參數(shù)依然是商業(yè)秘密，所以無論選擇 Y 型微流控、T 型微流控還是沖擊射流都需要在實際生產(chǎn)中不斷摸索具體的工藝參數(shù)，形成可用于規(guī)模放大的穩(wěn)定工藝體系。

 

 mRNA-LNP 組裝流程

 

mRNA疫苗生產(chǎn)中，將含有脂質(zhì)的乙醇相和含有mRNA的水相混合后形成脂質(zhì)超飽和狀態(tài)，主要過程如下：

 

利用微流控技術(shù)（Y型或T型），將含有脂質(zhì)的乙醇和含有mRNA的水相在pH=4的緩沖液中快速混合；

 

當可離子脂質(zhì)與水相相遇時，調(diào)節(jié)pH=5.5（介于緩沖液pKa和可電離脂質(zhì)的pKa之間），可離子脂質(zhì)發(fā)生質(zhì)子化形成陽離子脂質(zhì)；

 

陽離子脂質(zhì)與mRNA的陰離子磷酸骨架靜電結(jié)合，同時它在水相中具有疏水性，驅(qū)動囊泡的形成和mRNA的包裹；

 

提高pH=7.4，中和陽離子脂質(zhì)，使其疏水性增強，從而驅(qū)動囊泡融合，完成脂質(zhì)納米顆粒的進一步包裹。

 

純化工藝貫穿整個流程，高效的優(yōu)化策略至關(guān)重要

 

mRNA 疫苗生產(chǎn)過程中會產(chǎn)生很多雜質(zhì)，無論是在質(zhì)粒生產(chǎn)、純化與線性過程中，還是在體外轉(zhuǎn)錄、加帽等過程中，均會涉及到多步純化與超濾，如何保證上一步工藝不影響下一步工藝尤為重要，同時需要保證mRNA和遞送系統(tǒng)的穩(wěn)定性。

 

除了組裝工藝、純化工藝之外，在大規(guī)模生產(chǎn)中LNP粒徑均一、雜質(zhì)殘留等工藝也需要不斷完善。同時，如何在保持組分活性不下降的情況下，更高效的冷凍/干燥從而保持更長時間的穩(wěn)定性也是非常重要的生產(chǎn)工藝課題。

 

圖5 mRNA疫苗純化工藝生產(chǎn)流程示意圖 

來源：楚天人

 

D、市場前景

 

根據(jù)PubMed預計，2035年mRNA市場總體規(guī)模在230億美元，其中非新冠產(chǎn)品有望達到180億美元，2025-2035復合年均增長率（GAGR）達到68%。預防疫苗2035年市場規(guī)模在120-150億美元，其中新冠疫苗預計貢獻50億美元。其他疫苗預計2024-2025年開始進入市場銷售，隨著市場的開拓和放量，假設平均每個在研管線峰值為8億美元，預計2035年銷售額將達到70-100億美元。假設個性化腫瘤疫苗的銷售峰值為50億美元，單一腫瘤疫苗的銷售峰值為13億美元，治療疫苗2035年市場規(guī)模將達到70-100億美元，PubMed還預計治療藥物市場規(guī)模將達到40-50億美元。

 

總之，在 COVID-19 爆發(fā)之前，mRNA技術(shù)主要用于開發(fā)新的癌癥治療藥物，COVID-19大流行促進了mRNA 疫苗平臺的發(fā)展，與傳統(tǒng)疫苗相比開發(fā)周期快、無需細胞培養(yǎng)、免疫原性高， 但是充滿著挑戰(zhàn)。mRNA疫苗研發(fā)需要突破遞送系統(tǒng)、序列優(yōu)化、生產(chǎn)工藝具體參數(shù)等高技術(shù)壁壘。mRNA技術(shù)商業(yè)化時代已經(jīng)開啟是不爭的事實，在旺盛的需求下mRNA技術(shù)有望進入快速發(fā)展的黃金十年。

 

參考資料：

 

1.Advances in COVID-19 mRNA vaccine development. doi: 10.1038/s41392-022-00950-y.

2.中泰證券