摘要　目的：采集無菌制劑生產(chǎn)車間潔凈區(qū)環(huán)境微生物，應(yīng)用全自動微生物檢測系統(tǒng)進行監(jiān)測分析，并進行耐藥分析。方法：采樣方法有沉降菌法、定量空氣浮游菌采樣法和表面取樣法，對采集到的沉降菌、浮游菌、人員及設(shè)備表面微生物按照菌種鑒定儀使用說明書操作進行菌種鑒定和耐藥性檢測。結(jié)果：從 345個樣本中，檢出微生物115株，其中沉降菌105株，浮游菌6株，人員及表面微生物4株；115株菌鑒定為46個菌種，分屬于20個菌屬?？尚畔蘧?95% 以上。其中還檢出了3株耐藥菌。結(jié)論：對無菌GMP車間環(huán)境微生物進行監(jiān)測，并建立藥品GMP生產(chǎn)企業(yè)微生物信息庫，可以更好地指導(dǎo)藥品GMP 企業(yè)實現(xiàn)有效的微生物管理。

隨著《藥品生產(chǎn)質(zhì)量管理規(guī)范》（2010年修訂）（以下簡稱“GMP”）和《中華人民共和國藥典》（2015年版）的相繼推行實施，藥品生產(chǎn)的質(zhì)量管理水平已被提升到了新的高度，藥品GMP車間微生物監(jiān)控也備受重視和關(guān)注［1］。近年來，“欣弗事件”、“刺五加事件”等微生物污染藥品的事件仍有發(fā)生，對公眾用藥安全構(gòu)成嚴(yán)重的威脅［2-3］。因此，對藥品生產(chǎn)、檢測環(huán)境及過程中微生物種類及分布的研究，建立藥品生產(chǎn)及檢測環(huán)境中微生物信息庫，將有助于藥品GMP企業(yè)采取合適的消毒滅菌、過程分析措施控制藥品，特別是無菌藥品生產(chǎn)中的微生物污染，提高藥品質(zhì)量，為可能發(fā)生的、上市后藥品微生物污染藥害事件的溯源分析、無菌檢查“一次性檢驗”及應(yīng)急處理提供技術(shù)依據(jù)。對保障公眾用藥安全、有效，有著重大意義。

本試驗從藥品注射劑生產(chǎn)企業(yè)GMP車間及其周圍環(huán)境易受微生物污染的各個關(guān)鍵部位采集樣本，結(jié)合微生物生化鑒定等方法，建立藥品GMP生產(chǎn)企業(yè)微生物信息庫，指導(dǎo)藥品GMP企業(yè)實現(xiàn)有效的微生物管理。

一、材料與方法

1.1 材料

胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基及胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基均購自北京奧愽星生物有限公司。

VITEK2Compact自動微生物快速檢測分析系統(tǒng)（法國生物梅里埃公司）；Phoenix-100全自動細(xì)菌鑒定儀（美國海凈納（原美國杜邦）公司）

1.2 方法

1.2.1 質(zhì)控菌株鑒定　

取金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽胞桿菌和大腸埃希菌的 1 代培養(yǎng)物接種至胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基，于30~35 ℃培養(yǎng)18h，刮取菌苔用 Phoenix-100全自動細(xì)菌鑒定儀和VITEK2Compact 自動微生物快速檢測分析系統(tǒng)進行菌種鑒定，參數(shù)設(shè)置培養(yǎng)溫度為36 ℃，菌液濁度為0.5麥?zhǔn)蠞岫龋∕CF）。

1.2.2 樣品的采集　

根據(jù)GMP車間、周圍環(huán)境的房間數(shù)量和面積，對所有可能影響到產(chǎn)品質(zhì)量和易受微生物污染的關(guān)鍵部位進行微生物樣本采集。同時采集生產(chǎn)人員、設(shè)備等生產(chǎn)環(huán)節(jié)的微生物樣本。

主要采集2016—2018年的人員及設(shè)備表面微生物、沉降菌、浮游菌共345株，每個季度采集1次。①人員：采用壓指試驗、表面接觸（頭、胸、手腕、肘、膝蓋）平皿；②設(shè)備：表面擦拭；③環(huán)境：沉降菌（A級、B 級、C 級、D 級）、浮游菌（A 級、B 級）［4-7］。將所有的平皿置于30~35 ℃培養(yǎng)不少于3d。

1.3 環(huán)境微生物菌型檢測

將所培養(yǎng)的單菌落進行劃線分離，得到的單菌落轉(zhuǎn)接營養(yǎng)肉湯置-80℃冷凍保存。同時進行菌落形態(tài)觀察，并進行革蘭染色，根據(jù)染色結(jié)果選擇后繼菌種鑒定需要的是陽性還是陰性鑒定卡。然后按照VITEK2Compact 自動微生物快速檢測分析系統(tǒng)或Phoenix-100 全自動細(xì)菌鑒定儀說明書中的標(biāo)準(zhǔn)操作流程進行測定，一般2~10h給出鑒定結(jié)果。其中在Phoenix-100全自動細(xì)菌鑒定儀上同時進行細(xì)菌藥敏性試驗。

菌種鑒定實驗過程：（1）將分離純化的新鮮菌苔用無菌棉拭子加入到相應(yīng)的菌種鑒定用培養(yǎng)液中，調(diào)節(jié)麥?zhǔn)蠞舛鹊?.5，并混勻。（2）將菌液從菌種鑒定卡上端的加樣口緩慢加入。（3）掃描菌種鑒定卡后面的條碼，儀器自動識別后裝入儀器，開始運行，實驗結(jié)束后，讀取報告。

藥敏試驗過程：（1）使用之前，把藥敏指示劑溶液添加到藥敏培養(yǎng)液試管中并保存在黑暗中達8h。只用1滴從滴瓶自由落下的藥敏指示劑溶液。（2）將分離純化的新鮮菌苔用無菌棉拭子加入到相應(yīng)的菌種鑒定用培養(yǎng)液中，調(diào)節(jié)麥?zhǔn)蠞舛鹊?.5，并混勻。（3）用移液槍吸取25μL 上述菌液加入到藥敏培養(yǎng)液試管中。（4）將菌液從菌種鑒定及藥敏鑒定卡上端的加樣口緩慢加入。（5）掃描菌種鑒定卡后面的條碼，儀器自動識別后裝入儀器，開始運行，實驗結(jié)束后，讀取報告。

二、結(jié)果

2.1 質(zhì)控菌株檢測結(jié)果

用 VITEK2Compact 自動微生物快速檢測分析系統(tǒng)或Phoenix-100全自動細(xì)菌鑒定儀生物檢測系統(tǒng)對上述已知的金黃色葡萄球菌等共4株標(biāo)準(zhǔn)菌株作為質(zhì)控菌株進行檢測，結(jié)果與設(shè)定的標(biāo)準(zhǔn)菌株完全相符，可信度在98% 以上，見表1。

2.2 環(huán)境微生物鑒定結(jié)果

通過對所收集的環(huán)境菌共樣本345個樣品檢測結(jié)果進行整理和分析。檢出的微生物115株（其中人員及設(shè)備表面微生物4株，浮游菌6株，沉降菌105株）為46種菌種，分別來自20個菌屬。排在前3位的是葡萄球菌屬共48株，庫克菌屬共16株，鞘氨醇單胞菌屬共13株，其余的菌屬包括埃希氏桿菌屬、棒狀桿菌屬、巴斯德氏菌、伯克氏菌屬、腸球菌屬、泛菌屬、假單胞菌屬、顆粒鏈菌屬、克雷伯菌屬、鏈球菌屬、明串珠菌屬、氣單孢菌屬、沙雷氏菌屬、威克斯菌屬、微球菌屬、芽孢桿菌屬、耶爾森氏菌屬。根據(jù)革蘭氏染色結(jié)果分類，革蘭氏陽性總共92株，占總數(shù)80%；革蘭氏陰性總共23株，占總數(shù)的20%。詳細(xì)結(jié)果見表2。

結(jié)果表明：（1）浮游菌、人員及表面微生物共10株，以葡萄球菌革蘭氏陽性球菌為主占60%，其次為居泉沙雷菌及成團泛菌等革蘭氏陰性桿菌占30%。（2）沉降菌共105株，葡萄球菌屬、庫克菌屬、鏈球菌屬等革蘭氏陽性球菌占71%；其次為鞘氨醇單胞菌、氣單孢菌屬、假單胞菌屬等革蘭氏陰性桿菌占22%；革蘭氏陽性桿菌占1%；革蘭氏陽性芽孢桿菌占6%。詳細(xì)見圖1和圖2。其中檢出3株葡萄球菌具有耐藥性。檢出的其中1株耐藥菌的耐藥特征見圖3。

2.3 潔凈區(qū)微生物污染分析

2.3.1 Ａ級區(qū)污染微生物結(jié)果分析　

該企業(yè)Ａ級區(qū)環(huán)境菌監(jiān)控結(jié)果，共收集到4株微生物，占污染微生物總數(shù)的 3.5%。3株為少動鞘氨醇單胞菌，1株為庫克菌。在Ａ級區(qū)的微生物污染物數(shù)量、類型相對較少。說明A級區(qū)的微生物隔離系統(tǒng)起到了很好的隔離作用。也有可能是因為操作人員較少的緣故。

2.3.2 Ｂ級和Ｃ級區(qū)污染微生物結(jié)果分析　

Ｂ級和Ｃ級區(qū)共收集到111株微生物，占污染物總數(shù)的96.5%。環(huán)境微生物監(jiān)控分離微生物仍以葡萄球菌屬為主，合計48株（占Ｂ級和Ｃ級區(qū)總分離株的43.2%）。其中，沃氏葡萄球菌、腐生葡萄球菌和金黃色葡萄球菌分別占Ｂ級和Ｃ級區(qū)總分離株的8.1%、6.3% 和5.4%，且多分布在更衣室和潔凈走廊、消毒室，可見微生物污染與人員活動密切相關(guān)。

2.3.3 表面污染微生物結(jié)果分析　

采集到操作人員和設(shè)備表面微生物共4株均來自Ｂ級和Ｃ級區(qū)，占全部污染菌總數(shù)的3.5%。2株為葡萄球菌，1株為棒狀桿菌，1株為氣單胞菌。

三、討論

3.1 微生物污染源分析

從菌型分析結(jié)果可知，該無菌制劑生產(chǎn)企業(yè)潔凈區(qū)人員及設(shè)備表面微生物及沉降菌樣品檢出率最高的是革蘭陽性菌，而居其首位的是葡萄菌屬，此類菌廣泛存在自然界中，是人體的皮膚及呼吸道黏膜表面的正常菌群，當(dāng)機體免疫力低下時可引起

各種疾?。?］。其次為庫克菌屬，此類菌主要分布在水、土壤等自然環(huán)境中以及哺乳動物、人的皮膚、黏膜和口咽部。以往認(rèn)為克氏庫克菌是很少見的條件致病菌，未引起足夠的重視。近年來由該菌引發(fā)的感染增加較快，特別是血流感染和皮膚軟組織感染［9-10］。另外，最近楊銳等［11］從醫(yī)務(wù)人員手、皮膚黏膜、物體表面、空氣等醫(yī)療環(huán)境樣本中已檢出８株克氏庫克菌。第3位為鞘氨醇單胞菌，是一種能夠合成生物聚合物的重要微生物菌種資源。潔凈區(qū)檢出均為人員帶入，進入凈化區(qū)，樹立無菌觀念，從根本上降低污染的發(fā)生。從各區(qū)域微生物分離數(shù)量看，A級區(qū)的微生物污染數(shù)量明顯比 B級和C級區(qū)的微生物污染數(shù)量小很多，符合區(qū)域隔離和空氣凈化的規(guī)律［12-13］。

3.2 制藥企業(yè)微生物污染監(jiān)測作用

3.2.1 評價無菌車間滅菌程序的有效性　

無菌制劑車間環(huán)境微生物污染檢測可以評價無菌車間滅菌程序的有效性，可以根據(jù)微生物種類選擇適宜的消毒劑。該制藥企業(yè)分離的微生物采集到的微生物 91%以上為沉降菌。除了加強消毒驗證，還要注意高效過濾系統(tǒng)的清洗和更換頻率是否滿足要求。

3.2.2 建立警戒線和糾偏限　

通過對數(shù)據(jù)的分析建立警戒線和糾偏限，當(dāng)出現(xiàn)某種微生物或微生物指標(biāo)超限時就應(yīng)啟動滅菌程序。系統(tǒng)的關(guān)鍵參數(shù)比如微生物指標(biāo)超出正常范圍但未達到糾偏限度，需要引起警覺，可能需要采取糾正措施的限度標(biāo)準(zhǔn)為糾偏限度；系統(tǒng)的關(guān)鍵參數(shù)比如微生物指標(biāo)超出可接受標(biāo)準(zhǔn)，需要進行調(diào)查并采取糾正措施的限度標(biāo)準(zhǔn)。制訂警戒限度和糾偏限度方式：（1）（臨界值法）對一個時期內(nèi)所有數(shù)據(jù)以柱狀圖模式給出，原則取最近100個采樣數(shù)據(jù)，以第95區(qū)間和第 99 區(qū)間作為警戒限度和糾偏限度；（2）（正態(tài)分布法）警戒限度 = 平均值 +2σ；糾偏限度 = 平均值+3σ［14］。

3.2.3 對污染菌進行溯源分析　

當(dāng)監(jiān)測結(jié)果超出糾偏限度時，則必須立刻啟動偏差管理系統(tǒng)或管理系統(tǒng)，對系統(tǒng)超標(biāo)的原因進行調(diào)查，環(huán)境檢測建立的數(shù)據(jù)庫可以進行溯源分析，幫助判斷是哪一環(huán)節(jié)出現(xiàn)了問題［15］。

根據(jù)2010年版GMP要求，若無菌產(chǎn)品檢查結(jié)果出現(xiàn)陽性時，應(yīng)進行原因調(diào)查。隨著藥品檢驗技術(shù)和理念的不斷更新，《中華人民共和國藥典》2015年版微生物檢查法愈加關(guān)注生產(chǎn)過程中的微生物控制，強調(diào)通過“實驗室調(diào)查回顧、利用適宜方法”分析檢驗結(jié)果的準(zhǔn)確性。調(diào)查回顧涉及到藥品生產(chǎn)檢驗的人、機、料、法、環(huán)5個方面。而我們的實驗對GMP車間人員，設(shè)備和空氣系統(tǒng)進行監(jiān)測，建立了該企業(yè)凈化區(qū)的微生物數(shù)據(jù)庫，當(dāng)樣品中檢出陽性時，可以對檢出菌與數(shù)據(jù)庫中菌進行鑒別比對，同源性分析，找到可能的污染源，幫助企業(yè)采取高效有針對性的糾偏措施［16］。

3.2.4 對污染菌進行耐藥分析　

在檢出的細(xì)菌中有3株耐藥菌，均為葡萄球菌屬；1株為腐生葡萄球菌，能產(chǎn)青霉素酶，對吉他霉素、青霉素 G、紅霉素、和莫匹羅星產(chǎn)生耐藥；1株為表皮葡萄球菌，能產(chǎn)青霉素酶，對苯唑西林、青霉素G耐藥；1 株為沃氏葡萄球菌能產(chǎn)青霉素酶，對妥布霉素、青霉素G和紅霉素耐藥。

β- 內(nèi)酰胺類抗生素共同具有1個核心 β- 內(nèi)酰胺環(huán)，其基本作用機制是與細(xì)菌的青霉素結(jié)合蛋白結(jié)合，從而抑制細(xì)菌細(xì)胞壁的合成；β- 內(nèi)酰胺酶借助其分子中的絲氨酸活性位點，與β- 內(nèi)酰胺環(huán)結(jié)合并打開β- 內(nèi)酰胺環(huán)，導(dǎo)致青霉素類藥物失活，產(chǎn)生耐藥性［17］。據(jù)文獻報道，環(huán)境中人葡萄球菌和表皮葡萄球菌對頭孢類、氨基苷類、大環(huán)內(nèi)酯類和氟喹諾酮類藥物敏感；人葡萄球菌和溶血葡萄球菌對四環(huán)素類藥物敏感；葡萄球菌對磺胺類藥物有不同程度的耐藥［18-20］。

喹諾酮類藥物主要作用于細(xì)菌的DNA回旋酶和Ⅳ類拓?fù)洚悩?gòu)酶阻礙DNA復(fù)制，當(dāng)該2種酶的結(jié)構(gòu)變異即可導(dǎo)致耐藥，對喹諾酮類耐藥主要表現(xiàn)在gyrA 基因的變異而影響此類藥物與靶位的結(jié)合，從而影響細(xì)菌對藥物的敏感性，產(chǎn)生耐藥［21-22］。

試驗中的菌株均采集自生產(chǎn)抗生素藥品的GMP凈化車間，說明環(huán)境中的細(xì)菌長期與低劑量的藥物殘留共存，可能是導(dǎo)致菌株產(chǎn)生耐藥性的原因之一，要加強車間清洗驗證和監(jiān)控。