為了保證藥品的質量可控性，需要有基于“QbD”的質量標準及對應的分析檢測方法，然而在應用擬定的分析方法進行定量分析中，檢測結果出現偏差，經過一系列的偏差調查發現原因沒找到的時候，需要排查的一個重要因素是定量方法。

一 定量方法的概述

內標法：首先計算校正因子，根據校正因子計算供試品的量，具體公式如下：

外標法：包括外標一點法，自身對照法（加校正因子和不加校正因子），其中外標一點法采用對照品和供試品的峰面積和濃度進行含量的計算，公式如下：

通常校正因子在0.9-1.1之間或者無法獲得校正因子時直接應用自身對照法進行雜質限量計算，如果校正因子不在規定范圍內，需要增加校正因子進行計算，校正因子的公式如下：

標準曲線法：先計算濃度范圍內的標準曲線，然后根據供試品的響應值帶入標準曲線中計算供試品的量，公式如下：

面積歸一化法：測量各峰和色譜圖上除溶劑峰以外的總色譜峰面積，計算各峰面積占總峰面積的百分率。

標準溶液加入法：配制適當濃度的對照品溶液加入供試品溶液中，然后利用外標或內標法計算待測成分的含量，公式如下：

二“測不準”的案例

案例一：HPLC-ELSD方法中外標一點法計算的含量不準。

信息1：SD1、SD2、SD3的濃度分別為：0.01263mg/ml、0.02526mg/ml、0.030312 mg/ml；對應的峰面積A1、A2、A3分別為：2834.148、7633.898、9129.124；

信息2：供試品進樣分析后的峰面積AX為6009.84；

結果1：以C（mg/ml）為橫坐標，A為縱坐標線性回歸：y=360629.12x-1666.15，以對照濃度0.02526mg/ml進行外標一點法定量計算Cx=0.01989mg/ml；

結果2：以lgC為橫坐標，lgA為縱坐標線性回歸：y=1.361x+6.041，以標準曲線法將lgAX帶入線性方程后計算Cx=0.02177mg/ml；

討論：Cx=0.01989mg/ml與Cx=0.02177mg/ml相比，差了約8%。

ELSD是通用型檢測器，適用于無需具有光吸收特性的物質，如磷脂、糖類等物質的測定。ELSD的檢測原理是待測物隨著流動相進入霧化室內，被霧化成小液滴，被載氣帶入漂移管內，流動相被蒸發，待測物以溶質顆粒的狀態發生光散射，然后以光電倍增或光電二極管轉換信號進行檢測。在ELSD的方法中通常應用對數相關的方式進行線性回歸，因為在ELSD的檢測過程中隨著濃度的增加，信號響應的方差可能會隨之增大，為了使方差恒定，可以采用濃度和峰面積取對數后的線性回歸，并且在實際供試品含量計算時需要帶入線性方程進行計算，在ELSD的方法中不宜采用單點外標，至少兩點一線的曲線法進行定量計算。

案例二：離子色譜法檢測某陰離子時應用外標一點法計算回收率不合格。

信息1：SD1、SD2、SD3、SD4、SD5、SD6、SD7的濃度分別為：3.2330μg/ml、5.1728μg/ml、6.4660μg/ml、7.7592μg/ml、9.6990μg/ml、12.9320μg/ml、16.1650μg/ml；對應的峰面積A1、A2、A3、A4、A5、A6、A7分別為：0.2658、0.4186、0.5156、0.6082、0.7483、0.9742、1.1803；

信息2：供試品進樣分析后的峰面積A本底為0.5018；回收率試驗中峰面積A低為0.878；回收率試驗中峰面積A中為0.958；回收率試驗中峰面積A高為1.042；

信息3：回收率的可接受標準為95%-102%；

結果1：以外標一點法計算，對照濃度6.4660μg/ml，峰面積0.5156；計算得本底濃度6.2929μg/ml；回收率試驗中低91.2%、中88.5%、高87.3%，回收率均不符合要求；

結果2：以標準曲線法計算，以C（μg/ml）為橫坐標，A為縱坐標線性回歸：y=0.070x+0.053；計算得本底濃度6.4114μg/ml；回收率試驗中低96.2%、中99.2%、高100.5%，回收率均不符合要求；

討論：在離子色譜法中標準曲線法的準確度符合要求，離子色譜中電導檢測器，靈敏度較高，容易受到離子干擾，在定量計算中不適宜選擇外標一點法。

案例三：GC法檢測API中的殘留溶劑時應用外標一點法計算回收率不合格。

信息1：SD1、SD2、SD3、SD4、SD5的濃度分別為：25.05μg/ml、40.08μg/ml、50.10μg/ml、60.12μg/ml、75.15μg/ml；對應的峰面積A1、A2、A3、A4、A5分別為：53.18、85.62、104.58、127.52、158.96；

信息2：回收率試驗中濃度進樣分析峰面積為73.21；

信息3：標準溶液加入法制備供試品的回收率中濃度進樣分析峰面積為105.24；

結果1：以C（μg/ml）為橫坐標，A為縱坐標線性回歸：y=2.108x+0.334，在線性范圍內線性關系良好，用50.10μg/ml對應的峰面積104.58以外標一點法計算回收率為70.0%，不符合要求。

結果2：采用標準溶液加入法計算回收率為100.6%；

討論：在GC法檢查殘留溶劑中，因為API的存在很容易發生基質效應，為了避免基質效應帶來的測量誤差，可以采用標準溶液加入法進行定量。

案例四：HPLC法檢測有關物質時應用外標法重復性結果的RSD大于10%。

信息1：供試品在制備過程中經氮吹復溶離心后上清液進樣分析，雜質Ⅰ在供試品1、供試品2、供試品3、供試品4、供試品5、供試品6中的峰面積分別為293.224、367.666、313.320、355.254、311.634、288.539；

信息2：對照品溶液濃度5.0212μg/ml，對應的峰面積為360.24；

信息3：在供試品制備中加入內標物S，內標的濃度10.2481，對應的峰面積為354.18；內標和雜質Ⅰ在供試品1、供試品2、供試品3、供試品4、供試品5、供試品6中的峰面積分別為292.712、363.099、303.804、337.099、312.702、283.771和294.234、368.686、312.35、345.154、316.614、289.529；

結果1：外標法計算重復性的RSD為10.2%；

結果2：內標法計算重復性的RSD為0.8%；

討論：供試品制備過程復雜容易出現含量測不準，在定量方法的選擇中外標法存在測量結果不穩定的劣勢，此時引入內標物質，以內標法定量可以使測量結果更準確。

三定量方法的合適應用“場景”

外標法：適用于有雜質對照品，檢測器的專屬性很強的方法，并且在規定的線性范圍內應用?？蓱迷贖PLC-UV法的含量測定、雜質定量檢查等方法中。

標準曲線法：適用于濃度范圍較大，如50或100倍，需要在高低濃度區域內設置相應的濃度點進行線性回歸，供試品的響應值帶入標準曲線計算其含量?？蓱迷陔x子色譜法、HPLC-ELSD法、包封率測定、溶出曲線的測定、體內藥物分析等方法中。

內標法：適用進樣及樣品制備過程容易引入誤差的方法中，可應用在GC中手動進樣，供試品的制備過程復雜、微量物質分析等方法中。

標準溶液加入法：適用于基質效應明顯的方法中，可應用在GC殘留溶劑檢查、體內藥物分析等方法中。

面積歸一化法：適用于非微量物質分析，對檢測波長的要求較高，需要供試品中的物質全部出峰。應用于無法獲得對照品或者小試研究階段的雜質分析方法中。

綜上所述，在藥物研發的分析檢測過程中，發生測定結果偏離理論值很遠，方法學驗證項目不符合要求等情況，研究者在審視方法、儀器、系統誤差的同時，需要關注一下是否定量方法的選擇是合適的，本人結合工作中的案例淺析了定量方法的選擇條件，希望和廣大同行共同討論學習。

參考文獻：

《中國藥典》2020年版第四部.