輝瑞的新冠口服藥物PAXLOVID™（核心成分為PF-07321332）展現了驚人療效，今天給大家分享下其研發歷程。PF-07321332的研發故事得追溯到輝瑞在SARS期間發現的PF-00835231。當時輝瑞已經研發出PF-00835231，但隨著SARS在2003年的結束，臨床研發終止了。

偶然？17年前的沉寂分子煥發新生

Rupintrivir是人鼻病毒（HRV）3C蛋白酶抑制劑（1999年發現），隨后有科學家解出了TGEV（冠狀病毒的一種）Mpro與rupintrivir的共晶結構。TGEV的晶體結構曾被用來同源建模SARS的3CL蛋白酶結構，當時有科學家認為rupintrivir有可能會是設計SARS的3CL蛋白酶抑制劑的先導化合物。然而，輝瑞的研究人員發現rupintrivir對SARS的3CL蛋白酶活性很弱。以rupintrivir為起點，在保留Michael acceptor的基礎上，研究人員隨后優化得到活性還可以的SARS-mol2分子（本質是替換了合適的氨基酸側鏈）。最后，對SARS-mol2經過一系列的SAR優化得到共價抑制劑PF-00835231（見圖2或圖3的化合物1）。2020年新冠爆發時，輝瑞發現SARS和SARS-CoV-2病毒的3CL蛋白酶在與底物結合的催化域中的序列100% 相同，因此重新撿起了這個17年前的分子繼續研發。 

圖2. SARS-CoV-2-3CL蛋白酶與PF-00835231（和Cys145共價結合）的共晶結構（PDB：6XHM）。From: JMC

分子優化得到PF-07321332

如圖3所示，PF-00835231（即圖3的化合物1）的活性非常好且代謝穩定，但滲透性和口服利用度都很低，導致1很難口服給藥。為了改善1的滲透性和口服利用度，研究人員將1的α-羥甲基酮（因為較多氫鍵給體通常與口服生物利用度低有關）改為氰基得到化合物2。2的口服利用度F（1.4 vs. 7.6）和從胃腸道吸收的口服劑量分數Fa x Fg (3.3 vs. 38)都顯著提高，但活性明顯降低。隨后，研究人員同時引入氮雜雙環（模擬環狀Leu）和苯并噻唑，得到化合物3。如圖3所示，3的滲透性提升顯著（Papp：0.207 vs. 10.3），但3的氮雜雙環片段占據了疏水口袋，使其無法與Gln189形成氫鍵（如圖4C所示），導致其活性遠不如1。研究人員觀察到3的吲哚片段并沒有很好的占據口袋，為此他們將吲哚改為甲基磺酰胺，得到的化合物4與Gln189和Glu166都形成氫鍵，且各方面指標提升明顯（EC50=909 nM；F=10%；Fa x Fg =84）。

基于甲基磺酰胺的相互作用模式，研究者進一步優化得到含三氟乙酰胺的化合物5。5和4的Ki接近，但5的滲透性和EC50比4好10倍（Papp：13.1 vs. 1.56；EC50：85.3 nM vs. 909 nM），且5在老鼠和猴模型上的藥代動力學表現同樣優異（F分別為33%和7.9%；Fa x Fg分別為100%和66%）。最后，將5的苯并噻唑改為氰基即得到了臨床分子PF-07321332（即化合物6），6的活性和生物利用度進一步提升，且通過與SARS-CoV-2-3CL蛋白酶的孵育實驗發現6是可逆共價抑制劑。由于6具有便于放大合成、更好的溶解性（便于簡單制劑研究毒理學）和降低差向異構化等優點，研究人員選擇6進入臨床。

圖3. SARS-CoV-2-3CL蛋白酶抑制劑的體外和體內參數。從左到右分別為3CL蛋白酶活性Ki、抗病毒活性EC50、通透性Papp、內在清除率CLint、血漿清除率CLp、口服生物利用度F和從胃腸道吸收的口服劑量的分數 (Fa x Fg)。

圖4.（A）SARS-CoV-2-3CL蛋白酶與化合物1的共晶結構。（B）化合物3的二甲基-雙環 [3.1.0]脯氨酸模型（藍色）與亮氨酸殘基（青色）的構象疊加。（C）化合物3有效地填充了由 Met49、Met165 和His41 形成的親脂性口袋，但不能與Gln189形成有效的氫鍵。（D）化合物4與Gln189和Glu166都形成氫鍵。（E）臨床候選 PF-07321332（化合物6）與 SARS-CoV-2-3CL蛋白酶結合的共晶結構。(F) Cys145與化合物6的可逆共價結合。

改善代謝得到臨床藥物PAXLOVID

探究PF-07321332的代謝時，研究人員發現加入CYP3A4/5抑制劑時，PF-07321332在人肝微粒體的內在消除率（CLint）會顯著下降（24.5 vs. <4.33）；而且，CYP3A4 會對PF-07321332的多個位點（如叔丁基、氮雜雙環和吡咯烷酮）進行氧化代謝。這些結果表明CYP3A4對PF-07321332的代謝至關重要。為此，研究人員想通過與強效CYP3A4抑制劑利托那韋（RTV）共同給藥來提高臨床中PF-07321332治療濃度。利托那韋常用作蛋白酶抑制劑（如地瑞納韋、洛匹那韋等）的藥代動力學增強劑，這些蛋白酶抑制劑也是通過CYP3A4進行代謝清除。

圖5C顯示了單獨服用150mg PF-07321332和250mg PF-07321332+利托那韋獲得的成人初步血漿濃度與時間的藥代動力學曲線。PF-07321332 安全且耐受性良好，當與 RTV 共同給藥時，口服血漿濃度顯著增加且遠高于SARS-CoV-2抗病毒的EC90 值。

圖5. PF-07321332的臨床前毒理學和健康成人參與者單次上升劑量暴露研究。（A）每天一次給予PF-07321332的大鼠口服毒代動力學暴露（第14天）。（B）每天兩次給予PF-07321332的猴子口服毒代動力學暴露（第15天）。（C）成人口服150mg PF-07321332和250mg PF-07321332+利托那韋RTV的血漿濃度。（D）成人口服250mg PF-07321332和100mg利托那韋（t = -12、0、12小時）12小時內的血漿濃度 。

小結

PF-07321332的發現始于輝瑞在SARS期間的工作，雖然有偶然性，但充分展現了公司深厚的科研底蘊。輝瑞的科學家以擬肽rupintrivir為起點，通過替換類氨基酸殘基側鏈得到先導化合物SARS-mol2分子。隨后經過經典的SAR得到了活性很好的PF-00835231，再基于改善口服利用度的需求優化得到PF-07321332。最后通過藥代研究發現加入利托那韋能改善代謝消除率，得到臨床藥物PAXLOVID™。

參考文獻：

1. Peter S. Dragovich, et al. "Structure-Based Design, Synthesis, and Biological Evaluation of Irreversible Human Rhinovirus 3C Protease Inhibitors. 4. Incorporation of P1 Lactam Moieties as l-Glutamine Replacements". J. Med. Chem. 1999, 42, 1213–1224

2. Robert L. Hoffman, et al. "Discovery of Ketone-Based Covalent Inhibitors of Coronavirus 3CL Proteases for the Potential Therapeutic Treatment of COVID-19". J. Med. Chem. 2020, 63, 21, 12725–12747

3. DAFYDD R. OWEN, et al. "An oral SARS-CoV-2 Mpro inhibitor clinical candidate for the treatment of COVID-19". Science 2 Nov 2021

DOI: 10.1126/science.abl4784