雜質研究是藥品質量一致性評價的重點內容，關系到藥品的安全性、有效性和質量可控性。本文結合具體品種，匯總分析了雜質研究的常見問題及關注點，并提出相應的處理建議，旨在為后續口服固體制劑和注射劑仿制藥一致性評價的研究提供更多參考。

雜質是藥品的關鍵質量屬性，可能影響藥品的安全性和有效性。雜質研究是體外藥學研究的主要內容，貫穿于藥品的研發、生產及上市后變更等整個生命周期。口服固體制劑和注射劑仿制藥質量和療效一致性評價的相關技術要求[1—4]，均強調雜質研究是質量一致性評價的重點內容，要求進行多批次自制品與參比制劑的雜質譜對比研究，保證自制品與參比制劑的雜質水平一致。新4 類口服固體制劑和注射劑仿制藥的技術要求與一致性評價品種相同。化學藥品的雜質研究實際上已經有非常成熟的指導原則，如新原料藥和新制劑中的雜質應分別參照新原料藥中的雜質研究指導原則[ 人用藥品注冊技術要求國際協調會( ICH)Q3A]、新制劑中的雜質研究指導原則( ICH Q3B) 進行研究[5—6] ；化學藥品( 包括新藥、仿制藥) 均需參照《中華人民共和國藥典》(ChP)2020 年版四部通則“9102 藥品雜質分析指導原則”進行研究。

但是在審評中發現，除了雜質研究不充分外，還有其他一些問題，比如在雜質研究時忽略產品特性，研究的雜質不是潛在風險較高的雜質；與新技術要求脫節，研究方法落后，控制策略欠合理；雜質過度研究，使研發難度和投入增大、藥品上市延遲。我們并不提倡雜質過度研究，建議結合產品特點，以參比制劑信息為基礎，參照相關技術指導原則及國內外藥典收載情況，對雜質進行科學合理的研究及控制。本文結合審評案例，對化學藥品的雜質研究中常見的問題進行分析，提出相應的處理建議，為后續口服固體制劑和注射劑仿制藥質量和療效一致性評價提供參考。

1 雜質分析的基本原則

制劑中雜質來源主要有原料藥引入、制劑制備和貯存過程引入或降解產生等。在原料藥的雜質研究和控制符合要求的基礎上，制劑中主要對降解雜質進行研究，一般不需要再重復研究和控制原料藥的工藝雜質。雜質譜分析應結合原料藥的降解途徑、原料藥與輔料及內包材的相容性研究結果等，對產品中潛在的一般有機雜質、異構體、基因毒性雜質、殘留溶劑和元素雜質等進行詳細分析，說明雜質的來源、檢出結果、控制策略及擬定依據等。雜質研究可參照ICH 各項指導原則進行。但是ICH 指導原則主要針對新藥，因此研究仿制藥時，還應該結合仿制藥的特性進行，圍繞參比制劑的情況，如參比制劑的質量研究信息或藥典等法定標準等，進行全面的雜質分析和對比研究，并在此基礎上建立經規范驗證可行的分析方法，擬定合理的限度。

2 雜質分析及控制策略

2.1 一般有機雜質

雜質的種類較多，一般有機雜質區別于基因毒性雜質、異構體、殘留溶劑等，通常在質量標準中體現在有關物質項下。一般有機雜質的研究中通常只重點關注原料藥降解產生的雜質，而忽略了其他途徑引入的雜質，如制劑中的輔料、制備過程中使用的溶劑等與原料藥反應產生的工藝雜質或降解雜質。如琥珀酸普蘆卡必利片中若使用輔料乳糖，乳糖的羥基與琥珀酸普蘆卡必利結構中的氨基易發生取代反應，生成乳糖加合物雜質；穩定性研究表明水分會顯著加速該雜質的降解產生。對于使用了乳糖的處方，應進行該雜質的研究和控制，并考察穩定性試驗期間該雜質是否符合限度要求。

同樣，制劑中若使用了溶劑，除了考察溶劑殘留外，還應研究溶劑是否會與原料藥反應而產生雜質。如瑞舒伐他汀鈣片，在制備過程中若使用了乙醇等黏合劑，在制粒、干燥過程中高濕、高溫等因素的作用下，乙醇與瑞舒伐他汀酸反應可能生成乙酯雜質，美國藥典(USP)43 版中瑞舒伐他汀鈣片標準規定，若存在乙酯雜質，則其限度不得超過0.5％。因此進行制劑雜質研究時除了降解雜質外，還應關注原料藥與輔料、溶劑等在制備和存放過程中反應而產生的雜質。根據影響因素、穩定性試驗等考察結果確定是否為降解雜質及加速降解的條件，并與參比制劑進行雜質含量的比較，原則上該雜質含量不得大于參比制劑的限度標準。

若該雜質為自制品特有的雜質，且穩定性考察期間超過了鑒定限，則提示處方工藝或包裝材料等不合理，推薦首先進行相應的篩選和優化，降低雜質含量；若仍無法使雜質含量降低至鑒定限以下，則應進行結構確證及相關的毒理學研究，并評估確定擬定限度下的雜質不會對藥品的安全性和有效性產生影響。

2.2 異構體雜質

2.2.1 降解產生的異構體雜質

通常來講，異構體被認為是工藝雜質，在制劑雜質研究中易被忽略。實際上異構體雜質也是有機雜質的一種，研究思路、控制策略與有機雜質相似，依據來源也分為工藝雜質和降解雜質。部分藥品的異構體為降解雜質，如硫酸氫氯吡格雷，其結構中酯鍵的α- 位碳易受酸、堿條件的影響發生構型轉化，產生對映異構體雜質，故ChP 和USP 中均控制了對映異構體雜質。除非有可靠的文獻或原研專利等資料證明異構體雜質為工藝雜質，否則均應在制劑中進行研究，根據研究結果確定為非降解雜質時，可不訂入質量標準。

2.2.2 多手性中心藥物的異構體雜質

多手性中心藥物的異構體雜質較多，且非對映異構體雜質產生的概率比對映異構體更大，除監測對映異構體外，還應研究和監測非對映異構體。如替格瑞洛結構中有6 個不對稱手性中心，包括替格瑞洛在內，共可能產生64 個異構體，在終產品質量標準中建立合適的分析方法控制所有的異構體雜質難度極大，也不符合源頭控制和過程控制的理念。對于該類藥物的異構體雜質分析，通常采用分階段控制策略，首先結合合成路線及反應機制分析異構體雜質的來源，明確是來自起始原料、合成過程還是存放過程，再結合各個階段產生異構體雜質的風險及分析方法建立的難易程度等因素，擬定科學合理的控制策略。同時應注意，對于同為工藝雜質和降解雜質的異構體，僅在起始物料或中間體中控制并不能保證產品的光學純度，還應在制劑中進行異構體雜質研究。比如，替格瑞洛的三元環上7,9- 位手性碳構型不同的異構體雜質，除了由起始物料引入外，還可能由光照下2位的手性碳構型翻轉產生，因此在制劑中應進行這類異構體雜質的研究和控制[7]。

2.3 基因毒性雜質

自ICH M7《評估和控制藥物中的DNA活性( 致突變) 雜質以限制潛在的致癌風險》實施以來[8]，原料藥及制劑的上市申請應參照該指導原則進行基因毒性雜質研究。2018 年7 月發現已上市的纈沙坦原料藥中存在亞硝胺類雜質超標的事件，引起公眾對藥品安全性的關注。各國藥品監管機構對亞硝胺類雜質的研究不斷深入，警示信息及指導原則頻繁推出。2020 年5 月8 日，國家藥品監督管理局藥品審評中心發布《化學藥物中亞硝胺類雜質研究技術指導原則( 試行)》[9]。隨著對基因毒性雜質研究關注度的不斷提高，相關技術要求也不斷提升，要結合原料藥因素和制劑因素等綜合分析確定待研究的基因毒性雜質及來源，參照ICH M7 及毒理學研究數據等擬定合理的限度，建立靈敏度和準確度等驗證可行的分析方法，根據研究結果擬定科學合理的控制策略。

2.3.1 原料藥中引入的基因毒性雜質

原料藥中引入的基因毒性雜質一直是研究的重點，尤其對具有較高致癌性( 即“關注隊列”) 的物質，應保持更高的警惕性和敏感度。如纈沙坦原料藥中存在的亞硝胺類雜質主要包括N- 亞硝基二甲胺(NDMA) 和N- 亞硝基二乙胺(NDEA) 等，均屬于2A 類致癌物質，是ICH M7 指南中明確指出的“關注隊列”物質，應在藥品中予以嚴格控制。該類基因毒性雜質應采用“避免為主、控制為輔”的控制策略，從原料藥的工藝路線、物料污染、降解產生等方面評估引入亞硝胺類雜質的風險，盡量避免選擇可能生成該類雜質的生產工藝。若必須使用時，則須根據工藝路線分析可能生成的亞硝胺類雜質的結構，并優化工藝如篩選精制溶劑、增加雜質清除步驟等提高對該類雜質的清除能力，建立經驗證可行的分析方法用于過程監測和控制，保證生產過程中此類雜質的有效去除。

除沙坦類藥物外，其他藥物的制備中只要同時使用了胺類化合物與亞硝酸鹽，也應研究可能生成的相關亞硝胺類雜質。如替格瑞洛工藝路線( 圖1)的步驟2 在亞硝酸鈉/ 乙酸條件下進行重氮化環化反應[10]，理論上可能與胺類化合物如中間體M1 中含有的二級胺結構，或胺類試劑如三乙醇胺(TEA)、三乙胺等引入的二級胺試劑等相互作用，存在產生相應亞硝胺類雜質的風險，應參照相關指導原則進行風險評估和研究。

亞硝胺類雜質的限度極低，每日1.5 μg 的限度要求不足以充分控制風險，對于各藥品監管機構已公布限度要求的亞硝胺類雜質，擬定限度應不得高于公布限度；此外應參照ICH M7 指南的相關規定，根據此類雜質的安全性數據、制劑的用法用量等情況綜合確定合理的限度。

2.3.2 降解產生的基因毒性雜質

基因毒性雜質也可能是降解雜質，所以也要關注制劑在制備和貯存過程中產生的降解雜質。如制備甲磺酸達比加群酯膠囊時通常使用乙醇或異丙醇配制包衣液，醇類溶劑易與甲磺酸反應生成具有基因毒性的甲磺酸酯類雜質，制劑中應注意控制，并確保穩定性考察期間該類雜質限度符合ICH M7 要求。另外，雷尼替丁制劑在存放過程中，尤其是在高于室溫的環境下存放，隨著時間延長，NDMA 的含量可能逐漸增長至超過人體可接受水平。

2020 年4 月，美國FDA 要求藥品生產商從市場上撤回所有雷尼替丁的相關制劑。ChP 委員會對雷尼替丁相關的藥品標準也進行了修訂，要求企業對生產工藝進行評估以確定形成NDMA 等雜質的可能性。必要時，應采用適宜方法分析產品，確認NDMA 等雜質的含量符合我國藥品監管部門相關指導原則或ICH M7 指導原則的要求[11]。

由此可見，隨著科學技術的發展，對具有致癌、致突變性基因毒性雜質的研究越發深入，將會出現新的基因毒性雜質結構，已有基因毒性雜質的控制限度和方法也會隨之調整。因此在整個產品生命周期中均應關注基因毒性雜質的研究進展，與時俱進地開展研究，制定合理的控制策略。

2.4 殘留溶劑

在制劑制備時，溶劑一般用作黏合劑或配制包衣液，也應作為雜質譜的一部分進行分析研究。若能使用純化水替代，一般就不推薦使用溶劑，因為在制粒、干燥和包衣的高濕、高溫環境下，溶劑與主藥或輔料接觸可能會引入雜質，甚至是基因毒性雜質。應注意不推薦使用Ⅱ類溶劑，除非有充分的依據支持必須使用的合理性。如果使用，應進行溶劑殘留及相關反應產物的評估和研究。

2.5 元素雜質

元素雜質研究主要參照ICH Q3D《元素雜質指導原則》[12]。中國作為ICH 成員國，也在逐步推進ICH Q3D 的實施。《化學藥品注射劑仿制藥質量和療效一致性評價技術要求》明確提出應進行元素雜質的研究。根據不同給藥途徑的藥品中元素雜質的風險評估，口服固體制劑元素雜質的風險遠低于注射劑，口服固體仿制藥一致性評價時尚未要求研究元素雜質。但是，對部分存在高風險元素雜質的口服固體制劑也應參照指導原則進行研究。如原料藥合成反應中有意加入含有元素雜質的催化劑；來源于礦物或稀土的原料藥中含有多種天然存在的元素雜質，如碳酸鑭；部分特殊輔料中也可能引入元素雜質等。

3 分析方法的建立和驗證

有關物質分析方法的開發，應以充分的雜質分析作基礎。一般要求參照已有的標準如藥典標準、原研品檢測方法等，結合自制品的雜質種類、極性強弱等優化色譜條件，滿足方法系統適用性的要求。若自建方法與已有標準差異較大，一般要求提供2種方法的系統適用性、檢測靈敏度、多批自制品和參比制劑檢測結果的對比研究數據，說明自建方法的檢測能力不低于已有標準方法。

雜質種類的增加要求更好的適用性，限度的降低要求更高的靈敏度，方法學驗證應證明自建方法可滿足雜質檢測的適用性、靈敏度、準確度等要求。方法學驗證已有明確的指導原則，以下主要介紹幾個關注點。

系統適用性要求擬定時，應關注不易分離的主峰與雜質峰、相鄰的2 個及以上雜質峰，這些色譜峰之間的分離度受到色譜條件波動的影響很可能不符合要求，應將這些色譜峰之間的分離度要求制定入系統適用性標準。系統適用性應反映實際樣品檢測時的分離度情況，主成分濃度應與供試品溶液一致，已知雜質的濃度應不低于限度濃度。對于靈敏度較低的分析方法，為保證每次樣品檢測時的靈敏度均能滿足要求，建議系統適用性中增加靈敏度溶液和要求。

選擇有關物質檢測波長時應兼顧主成分和大多數已知雜質的最大吸收波長；個別與主成分紫外吸收差異較大的雜質，應根據校正因子的測定結果選擇用外標法或加校正因子的主成分自身對照法計算。校正因子測定的前提是獲得含量準確的已知雜質對照品，同時應進行全面的校正因子驗證，否則會影響測得校正因子的準確性，進而影響雜質檢測結果。

人體可接受的基因毒性雜質的限度很低，對分析方法的靈敏度、準確度等有更高的要求；且部分基因毒性雜質性質活潑、穩定性差，痕量分析極具挑戰性[13]。建立分析方法時可參照國內外藥品監管機構、藥典等公布的方法，結合自制品的特點建立合適的分析方法，并進行全面的方法學驗證。制劑中基因毒性雜質檢測時的輔料因素以及供試品溶液配制方法，如提取溶劑種類和用量、超聲時間、離心轉速和時間、濾膜材質和孔徑等，均可能影響提取回收率，應進行考察，必要時應將相關規定制定入質量標準。

質量標準控制多個已知雜質時，推薦采用準確度高的雜質對照品定位法，并將典型的系統適用性圖譜作為質量標準的附件，以便準確定位已知雜質；若采用相對保留時間定位，色譜柱的品牌、型號，流動相比例，柱溫等色譜條件的微小變化均可能影響雜質的相對保留時間，尤其對相鄰且限度差異大的雜質，定位錯誤就會影響對產品質量合格與否的判斷，故要進行相對保留時間的耐用性考察，必要時改用雜質對照品定位法或者將影響較大的色譜條件固定并制定入質量標準。

對于部分穩定性較差的藥物，還應根據溶液穩定性研究結果評估是否需要在標準中增加“避光操作”和“臨用現制”等特殊操作要求。

4 結論

仿制藥的雜質研究應堅持2 個基本原則，以藥品的特點為基礎，以參比制劑為參照，否則很容易出現雜質研究不全面或過度研究的問題。雜質是藥品的關鍵質量屬性，充分的雜質研究是擬定科學合理的質量標準的基礎，更是藥品的安全性、有效性、質量可控性的重要保障。同時，雜質研究也是一個發展的過程，需要隨著技術的進步、監管要求的提升，及時開展研究，建立一個完善合理的質量保證體系以保證產品在批準后的整個產品生命周期達到與參比制劑質量的一致。

作者｜趙 娜，石 靖*（CDE）

內容來源｜中國醫藥工業雜志 2021.05