［摘要］ 治療性單克隆抗體( 單抗) 類藥物是高度均一的生物大分子，抗原表位、理化性質和生物活性等方面的均一性程度高，能夠通過特異性地與靶標分子結合發揮治療作用。單抗類藥物治療過程中不良反應發生率低、患者耐受性高。單抗類藥物是生物藥物領域的熱點和焦點，已成為現代生物制藥行業中占比最大、增長最快的細分領域。根據生產技術和工藝的不同，單抗類藥物發展已經經歷了4 代。我國最近批準上市的信迪利單抗注射液、特瑞普利單抗注射液、注射用卡瑞利珠單抗和替雷利珠單抗注射液等均屬于第3 代人源化單克隆抗體藥物。單抗類藥物分子結構復雜，容易發生二聚體、多聚體、末端氨基酸突變等不均一性變化，嚴重影響臨床用藥的安全性和有效性。對單抗類藥物的原液和成品進行有效的質量控制是確保該類產品安全性和有效性的重要措施。目前，單抗類產品質量控制與分析的主要方法包括高效液相色譜( HPLC) 法、酶聯免疫吸附測定( ELISA) 法、毛細管區帶電泳( CZE) 法、毛細管等電聚焦電泳( cIEF) 法、成像毛細管等電聚焦電泳( iCIEF) 法和十二烷基硫酸鈉-毛細管電泳( CE-SDS) 法等。本文就單抗類藥物質量控制分析方法及應用進行綜述，為相關研究及產品質量控制提供參考。

傳統的抗腫瘤化療藥物通過干擾腫瘤細胞有絲分裂、阻止DNA 復制和損傷DNA 分子發揮抗腫瘤作用。化療藥物不良反應多、選擇性差的特點決定了其臨床應用受到較大限制。單克隆抗體( 單抗)類藥物是經過分子生物學手段制備的、由單一B 細胞克隆得到的高度均一的生物大分子［1-2］。單抗類藥物抗原表位、理化性質和生物活性等方面的均一性程度高，能夠特異性與靶標分子結合，治療過程中不良反應發生率低、患者的耐受性高［3-4］。從1986年全球第一個鼠源性單抗藥物Muromonab OKT3 上市以來，單抗類藥物經歷了人鼠嵌合單抗( 第2代) 、人源化單抗( 第3 代) 的進步，已發展至如今的第4 代的全人源化產品。

治療性單抗類藥物屬于結構復雜的生物大分子，經過細胞培養、分離純化和運輸保存等過程，容易發生不均一性變化，如形成二聚體和多聚體、發生末端氨基酸突變、脫酰胺化和糖鏈變化等結構的變異［5］。這些變異和不均一性將嚴重影響單抗類抗腫瘤藥物的臨床效果和安全性。隨著生產工藝的不斷優化和分析技術的進步，單克隆抗體藥物的質量控制將日趨規范和嚴格，各國藥品監督管理部門也在不斷提升該類產品的質量控制要求。有效的質量控制分析方法是進行原液和成品質量控制、確保單抗類產品安全性和有效性的基礎。目前，單抗類產品質量控制與分析的主要方法包括高效液相色譜( high performance liquid chromatography，HPLC) 法、酶聯免疫吸附測定( enzyme linked immune-sorbent assay，ELISA) 法、毛細管區帶電泳( capillary zone electrophoresis，CZE) 法、毛細管等電聚焦電泳( capillary iso-electric focusing，cIEF) 法、成像毛細管等電聚焦電泳( imaging CIEF， iCIEF) 法和十二烷基硫酸鈉-毛細管電泳( capillary electrophoresis-sodium dodecyl sulfate，CE-SDS) 法等。本文分析單抗類產品分析技術與應用進展，為單抗類藥物原液和成品的質量控制提供參考。

1 單抗類抗藥物

單抗類藥物是生物藥物領域的熱點和研發的焦點，是現代生物制藥行業中占比最大、增長最快的細分領域。根據生產技術和工藝的不同，單抗類藥物發展經歷了4 代。第1 代為鼠源單抗，通過小鼠細胞生產抗體，產品的不良反應發生率高( 50% ～80%) ; 第2 代為人鼠嵌合單抗，使用人源C 區替代鼠源C 區，臨床應用的不良反應發生率相對較低( 1% ～ 57%) ; 第3 代為人源化單抗，采用互補決定區( complementary determining region，CDＲ) 移植體和特異性決定殘基( specificity-deter mining residue，SDＲ) 移植體生產，臨床應用的不良反應發生率低( ＜ 10%) ; 第4 代為全人源化單抗，采用基于噬菌體展示技術的全人單抗技術平臺生產，不良反應發生率極低［6］。

單抗類抗腫瘤藥物是單抗類藥物家族的重要成員，因其具有較高的特異性和較低的不良反應發生率以及患者的耐受性好而得到廣泛應用［7-8］。近年來美國FDA 和國家藥品監督管理局( NMPA) 均批準了一系列用于治療惡性腫瘤的單抗類藥物，如曲妥珠單抗( 赫賽汀) 、利妥昔單抗注射液( 美羅華)等，見表1。值得指出的是，NMPA 近2 年新批準了一系列的單抗類抗腫瘤藥物，包括信迪利單抗注射液( 2018 年12 月獲批) 、特瑞普利單抗注射液( 2018年12 月獲批) 、注射用卡瑞利珠單抗( 2019 年5 月獲批) 和替雷利珠單抗注射液( 2019 年12 月獲批)等，標志著抗腫瘤免疫治療進入了“中國創新時代”［9-10］，見表1。

2 單抗類藥物的質量控制參數

單抗類抗腫瘤藥物分子結構復雜，容易發生二聚體和多聚體、末端氨基酸突變等不均一性變化，嚴重影響臨床用藥的安全性和有效性。對抗腫瘤類單抗產品的原液和成品進行有效質量控制是確保該類產品安全性和有效性的重要措施。以我國最近批準的PD-1 /PD-L1 抑制劑類單抗為例，原液的質量控制參數主要包括鑒別( 等電點、肽圖譜) 、理化檢定( 外觀、pH、滲透壓摩爾濃度) 、純度( 單體含量、重鏈、非糖基化重鏈和輕鏈等) 、雜質( 蛋白質A 殘留量、宿主細胞DNA 殘留量、宿主細胞蛋白殘留量) 、生物學活性( 或效價) 、蛋白質含量、細菌內毒素和微生物限度、糖基化分析、聚山梨酯20 等。PD-1 /PD-L1 抑制劑類單抗成品的質量控制的參數包括鑒別( 等電點、肽圖譜) 、理化檢定( 外觀、可見異物、不溶性微粒、裝量、pH、滲透壓摩爾濃度、復溶時間、水分) 、純度( 單體含量、重鏈、非糖基化重鏈和輕鏈等) 、生物學活性( 或效價) 、結合活性、蛋白質含量、無菌和細菌內毒素、異常毒性、聚山梨酯20、聚山梨酯80 含量、甘露醇含量等。

3 單抗類抗腫瘤藥物參數分析的主要技術

單抗類抗腫瘤產品參數分析的主要技術包括HPLC 法、ELISA 法、CZE 法、cIEF 法、CE-SDS 法等。

3.1 HPLC 法

用于單抗類抗腫瘤產品的分析的HPLC 方法主要有反向-超高效液相色譜法( reverse phage-ultra high performance liquid chromatography，ＲP-UHPLC) 、體積排阻色譜( size exclusion high performance liquid chromatography，SEC-HPLC) 、陽離子交換高效液相色譜( cation exchange high performance liquid chromatography，CEX-HPLC) 、離子交換高效液相色譜( ion exchange-high performance liquid chromatography，IEC-HPLC) 和熒光檢測器-高效液相色譜儀( fluorescence detector HPLC，FLD-HPLC) 等［21-24］。

肽圖譜分析是通過蛋白酶或其他化學物質對蛋白質進行裂解后采用適宜的方法對蛋白質的一級結構的完整性和準確性進行鑒別的手段。胰蛋白酶水解聯合ＲP-HPLC 或ＲP-UHPLC 是《中華人民共和國藥典》收載的用于生物制品肽圖檢查的方法之一，也是抗腫瘤類單抗鑒別的重要參數。另外，高效液相色譜-質譜聯用技術鑒定蛋白質一級結構準確度高，也用于分析單抗類產品的肽圖。SEC-HPLC法是分析單抗分子大小異質性的主要手段，能夠全面反映單體、單抗聚體和殘體等的信息，是單抗類產品純度和雜質質量控制的重要方法。IEC-HPLC 可用于分析單克隆抗體抗腫瘤藥物中不同電荷異構體的比例，與cIEF 手段結合可有效分析單抗類抗腫瘤藥物的酸性峰、堿性峰和主峰。CEX-HPLC 屬于離子交換色譜范疇，主要用來分析等電點為弱堿性單抗藥物的電荷異質性。有研究發現，CEX-HPLC 可以有效分離重組人源化抗白細胞分化抗原52( cluster of differentiation 52，CD52) 單克隆抗體的酸性、中性及堿性電荷變異體，且專屬性、線性、準確性、精密度和耐用性良好［25］。將人乳頭瘤病毒( human papilloma virus，HPV) 18 型L1 抗原用胰蛋白酶水解后的肽段用反向液相色譜( ＲP-HPLC) 法分離得到抗原肽圖，并采用HPLC-MS /MS 肽圖特征峰分析可對不同企業生產的18 型的HPV L1 抗原進行鑒別與質量控制［26］。郭莎等［27］通過采用SEC-HPLC 可有效分析單體的峰面積，采用IEC-HPLC 可有效檢測酸性區峰面積、主峰峰面積、堿性區峰面積，并以此建立了抗PD-L1 單抗的多種質控方法。在建立抗白細胞分化抗原38( cluster of differentiation 38，CD38)單克隆抗體關鍵質量屬性質控方法時也證實SECHPLC 分析可用于CD38 純度控制［28］。采用HPLC-肽圖法對抗人CD52 單抗的專屬性鑒別時也證實輔料制劑和異種抗體對CD52 單抗的檢測結果無干擾，且HPLC-肽圖適于CD52 單克隆抗體的專屬性鑒別、質量控制和產品批放行［29］。同時，在建立PD-1 單克隆抗體關鍵質量指標質控方法時也發現SEC-HPLC 法、ＲP-HPLC 法及CEX-HPLC 法可進行PD-1 單克隆抗體單體的純度、單體和聚合體含量、電荷變異體分析，這些方法是PD-1 單克隆抗體制品常規質量控制的有效方法［30］。

3. 2 ELISA法

ELISA 法是繼免疫熒光和放射免疫技術之后出現的免疫酶技術，通過將可溶性的抗體或抗原分子結合到固相載體上，然后利用抗原-抗體特異性結合特性的免疫反應進行定性或定量的分析方法［31-32］。在抗腫瘤類單抗藥物質量控制過程中，ELISA 法可用于分析蛋白A 殘留、宿主細胞蛋白殘留，細胞競爭性或配體競爭性ELISA 法可用于單抗類藥物生物學活性的分析。采用競爭抑制ELISA法發現抗血管內皮生長因子165 ( VEGF165) 單抗VG2 抑制VEGF 與受體結合，提示VG2 單抗能夠抑制VEGF 引起的人臍靜脈內皮細胞( HUVEC) 的增殖，即競爭抑制ELISA 方法可作為VG2 單抗生物學活性質量評價的手段［33］。宋媛媛等［34］成功建立了基于ELISA 法進行人血清中重組人鼠嵌合型抗CD20 單克隆抗體注射液( SCT400) 和利妥昔單抗免疫原性分析和藥物濃度檢測方法，并成功運用于臨床試驗樣本的免疫原性檢測。另外，采用ELISA 定量檢測方法分析抗CD52 單克隆抗體中殘留蛋白A的定量限為0.16 ng·mL-1，蛋白A 的加標回收率均處于80%~120%，即ELISA 定量檢測方法檢測抗CD52 單抗中蛋白A 殘留量的專屬性、準確度、精密度和線性均良好［35］。但ELISA 法用于單抗類抗腫瘤藥物質量分析時也存在一定的局限性，如需經過孵育和洗滌等多步操作、容易受到外源或內源性物質的干擾，檢測依賴高親和力和高特異性的高品質單克隆抗體試劑等。已有的證據顯示不同的單抗類藥物與脫落的蛋白A 的結合程度不同［36］，需要根據不同單抗產品特性進行相關的研究，建立適合于特定單克隆抗體的蛋白A 殘留ELISA 檢測方法。

3.3 CE-SDS 法

十二烷基硫酸鈉( SDS) 是陰離子表面活性劑，可以斷裂蛋白分子分子內和分子間的氫鍵、破壞其二級結構和三級結構使其伸展。雖與十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳( SDSPAGE)法的電泳原理相同，CE-SDS 是液態膠在毛細管中按照分離量的大小進行蛋白的分離，自動化程度高，分離效率和重復性均優于SDS-PAGE［37］。在單抗類產品質量控制領域，CE-SDS 法已經基本取代了SDS-PAGE 法。《中華人民共和國藥典》也將CESDS法作為單抗藥物分子大小變異體的分析手段。根據樣品處理過程中使用N-乙基順丁烯二酰亞胺( NEM) 或β 巰基乙醇的不同，CE-SDS 法區分為非還原CE-SDS 法和還原CE-SDS 法( 使用β 巰基乙醇、二硫蘇糖醇等還原劑進行樣品處理) 。通過CESDS法分析可將目標成分和雜質有效分離，且能區分多批重組人源化PD-1 單抗產品間的細小差異，即CE-SDS 法適用于PD-1 單抗產品純度和相關雜質的質控分析［30］。在應用CE-SDS 法分析抗CD52 單抗參比品單體純度和非糖化重鏈比例時發現非還原CE-SDS 法測定單體純度為93. 57%，還原CE-SDS法電泳重鏈修正峰面積為66.89%，CE-SDS 法測定抗CD52 單抗純度及非糖化重鏈比例偏差小，結果準確可靠［38］。郭莎等［27］在對抗PD-L1 單抗的質量控制進行分析時證實還原CE-SDS 法的輕鏈與重鏈峰面積之和為( 98.37 ± 0. 21) %，非還原CE-SDS 法主峰峰面積為( 96.33 ± 0.15) %，CE-SDS 法可用于抗PD-L1 單抗純度的質量控制。在采用CE-SDS 法分析HEＲ2 單抗質量時也發現非還原CE-SDS 法檢測的酸性異構體、預洗脫雜質、原液的主峰含量為90.83%，53.93%， 95.83%，小分子雜質含量分別為9.17%， 46.07%，4.17%，還原CE-SDS 法檢測的酸性異構體、預洗脫雜質、原液的輕、重鏈百分含量分別為96.80%，78.00%， 98.85%，即CE-SDS 法可用于HEＲ2 單抗的純度分析［20］。非糖基化重鏈是抗體藥物質量控制的關鍵參數，對抗體藥物的體內外穩定性、半衰期等生物學活性起關鍵的作用，而CESDS法是目前唯一能夠將抗體非糖基化重鏈與重鏈進行分離和進行準確定量的技術［39］。目前采用CE-SDS 法分析單抗藥物純度時采用的檢測手段主要為紫外檢測( UV 和PDA) 和激光誘導的熒光檢測。與前者相比，激光誘導的熒光檢測靈敏度高，可對痕量的蛋白質進行分析，而紫外檢測器可消除背景膠中紫外吸收引起的基線波動，自動積分更準確［40-41］。為保證CE-SDS 法可靠穩定，研究人員采用了在毛細管兩端增加相同的電壓、反吸法移取凝膠溶液等手段提高CE-SDS 法的穩定性，并采用多通道毛細管電泳分析抗體藥物純度以提高檢測的通量［42-43］。

3.4 cIEF 法與iCIEF法

cIEF 和iCIEF 均屬于毛細管電泳的范疇，在基于電荷的分離技術中其分辨率是最高的［44 － 45］。根據待分離物質等電點的不同，將其在pH 梯度內將酸堿兩性物進行電泳分離，并最終在與物質等電點相等pH 值的位置聚集成條帶。單抗類產品生產過程中涉及糖基化、末端氨基酸改變、異構化、聚合、分裂等翻譯后修飾，而這些修飾均會引起單抗表面電荷的改變，包括直接改變電荷的數目和間接引起構象的改變，即單抗類抗腫瘤藥物的電荷異質性。在單抗類抗腫瘤產品質量控制過程中，cIEF 法和iCIEF`法主要用于分析產品的等電點和電荷異質性［46 -47］。在對重組抗腫瘤壞死因子α ( TNF-α) 全人源單抗分析時發現cIEF 法和iCIEF 法可用于主峰與酸性峰的比例分析，但二者檢測抗體主峰等電點具有差異性，提示在實際應用時應結合單抗藥物的特性和表征選擇合適的電荷異質性分析方法［48］。劉振東等［49］建立了iCIEF 分析血管內皮生長因子受體-抗體Fc 融合蛋白的電荷異質性，發現iCIEF 法分離效果明顯好于cIEF 和IEF，即iCIEF 法用于重組蛋白類藥物電荷異質性及等電點快速、準確、重復性好，能夠較好地檢測高度糖基化的重組血管內皮生長因子受體-抗體Fc 融合蛋白產品的電荷異質性，保障了Fc-融合蛋白類產品生產工藝的穩定性，為該產品質量控制提供了快速、可靠的分析方法。在評價全柱成像毛細管電泳( capillary isoelectric focusing-whole column imaging detection，cIEF-WCID) 檢測多肽類藥物等電點的效果時，證實該方法可快速、準確地分析具有電荷異質性的多肽類產品的等電點，且能夠跟蹤聚焦過程中樣本的遷移特征，對復雜電荷異質性蛋白類藥物檢測具有較好的分辨率和重復性［50］。美國藥典36 版也收錄了cIEF 作為單抗類藥物曲妥珠單抗和利妥昔單抗的電荷異質性分析方法。除了單克隆抗體外，cIEF 也可以對抗體偶聯藥物( antibody-drug conjugate，ADC) 進行電荷異質性的分析［51-52］。

3.5 毛細管凝膠電泳( capillary gel electrophoresis，CGE) 法

在毛細管電泳的多種分離模式中，CEZ法分析主要依靠分子量大小進行分離，cIEF 分析依靠單抗的等電點進行分離，而CEZ 法是依靠單抗類藥物電荷/質量比進行分析，是最簡單、最常用的毛細管電泳類型。由于單抗類藥物各個變異體之間的質量差別不大，主要變異來自氨基酸的翻譯后修飾，具體體現在表面電荷的不同。CEZ 法的分離模式與cIEF 法相似，但前者比后者更簡單、更便捷。CEZ法與質譜聯用后可以依靠后者對毛細管電泳分離的電荷變異體進行結構分析。在對IgG2 型單抗電荷異質性進行毛細管區帶電泳分析時證實CZE 法可以有效分離IgG2 單抗電荷異構體，精密度良好，峰面積ＲSD ＜ 3. 0%，提示CZE 法可以對該類單克隆抗體的電荷異構體有效分離［53］。在對常用的單克隆抗體電荷異質性分析時證實IEC 法和CZE 法在檢測的電荷異構體峰面積時結論基本一致，但二者與CIEF 法和iCIEF 法檢測的抗體主峰等電點存在一定差異［38］。雖然CEZ 法操作簡單便捷，但單抗類藥物的多樣性決定了沒有任何一個分離條件能對所有的藥物實現最佳的分離效果。在采用CZE 法分析單抗類藥物的電荷異質性時，應綜合考慮pH值、三乙烯四胺( TETA) 濃度、羥丙基甲基纖維素( HPMC) 或羥丙基纖維素( HPC) 等聚合物添加劑等因素。

3.6 定量聚合酶鏈式反應( polymerase chain reaction，PCＲ) 法及其他

外源性DNA 是通過病毒感染或基因工程等途徑引入靶細胞的其他物種或細胞的DNA 序列，是單抗類等生物制品質量控制的關鍵項目［54-55］。現行有效的國際主流藥典都對生物制品中外源DNA 殘留做了明確的限度規定。定量PCＲ 法、閾值法、熒光染料法及分子雜交等都是分析外源性DNA 的常用手段，其中定量PCＲ 法是目前批準的抗腫瘤類單克隆抗體產品中外源性DNA檢測的通用方法。最近新上市的信迪利單抗注射液、注射用卡瑞麗珠單抗及特瑞普利單抗注射液等均是來自中國倉鼠卵巢細胞( CHO) ，經細胞培養、分離和純化后獲得的重組單克隆抗體。目前這類抗腫瘤單抗的質量控制標準中均是采用定量PCＲ 法對相應的外源性DNA 進行分析。

單抗類抗腫瘤產品的原液通常是采用常規法或薄膜過濾法進行微生物限度檢查，產品的無菌檢查均采用薄膜過濾法進行; 蛋白質含量的檢測采用紫外分光光度法進行; 細菌內毒素檢測采用凝膠法進行。支原檢查可采用PCＲ 法進行初篩和產品放行，但結果存在爭議時要以培養法結果為仲裁標準。其他的分析項目，如外觀、性狀、可見異物、摩爾滲透壓、pH 值、裝量和不溶性微粒及異常毒性等均采用常規法。

4 問題與展望

單抗類藥物已成為制藥領域研究的熱點和焦點。在全球生物制藥領域中，單抗類藥物占據了50%左右的份額。單抗類抗腫瘤藥物是單抗類藥物的重要組分，且隨著信迪利單抗注射液、特瑞普利單抗注射液、注射用卡瑞利珠單抗和替雷利珠單抗注射液等一系列抗腫瘤單抗的獲批，抗腫瘤免疫治療進入了“中國創新時代”。單抗類抗腫瘤藥物為結構復雜的生物大分子，經翻譯后修飾容易發生二聚體、多聚體、末端氨基酸突變、糖基化等不均一的變化，嚴重影響臨床用藥的安全性和有效性。為確保抗腫瘤類單抗產品安全性和有效性，需對原液和成品進行有效的質量控制。目前單抗類產品質量控制與分析的主要方法包括HPLC 法、ELISA 法、CZE法、cIEF 法、iCIEF 法和CE-SDS 法等。本文對上述的常用分析方法及應用進行了綜述，可為相關研究及產品質量控制提供參考。但應當指出的是由于單抗類抗腫瘤藥物的迅猛發展，不同的單抗產品質量控制所采用的方法可能與藥物的一級結構、二級結構、電荷屬性等因素有關。因此，為確保所采用的方法適合于特定的產品，需對產品的理化特性進行分析研究，建立適合于特定單克隆抗體的分析方法。