有關物質較含量測定而言是一個更加復雜和瑣碎的體系，含量測定僅要求準確分析主成分，有關物質旨在研究所有應研究的雜質。

然而，研究沒有那么容易，每個雜質有它的脾氣 。

有關物質的研究思路

研究思路這個部分，應該由分析人員與合成人員共同討論商定。項目開展前期，討論會的頻率會比較高，研究思路可能也會隨著討論而發生很多變化。

1.合成路線

API的工藝路線是雜質研究的關鍵，捋順工藝路線，可以清楚每個雜質的來源和去向，更有針對性地給出雜質控制的策略。比如，哪些雜質可以僅在起始物料中分步被控制，后續API中無需再研究；比如，是否有些雜質在工藝中一直會有產生的可能性，那么僅在終產品中控制才能將其完全控制住，在前幾步反應的研究中僅對其進行專屬性的研究即可。

Sofosbuvir (索磷布韋)工藝路線

2.雜質譜分析

分析各工藝雜質是從哪一步得來的，如何產生；分析各降解雜質是由什么條件降解而來（要綜合前期降解試驗結果而考慮），列出雜質產生機理，然后再將雜質信息匯總成表格，推薦格式如下：

雜質限度的制定

ICH Q3A中關于原料藥的雜質限度規定見下表：

ICH Q3B中關于制劑的雜質限度規定見下表：

根據參比制劑說明書或查找相關文獻，可得知藥品的最大日劑量，根據ICH指導原則的相關規定，對應查找雜質限度。值得說明的是，即使按照ICH指導原則來看，對應報告限度為0.05%，它只是針對檢驗這個產品是否合格、是否可放行時的報告限度，在研究階段不建議將0.05%以下的小雜質忽略不計。

若真的忽略掉，很可能會忽略掉一些降解趨勢或是產品的其他特性。

另外還要仔細對比和研究各已有標準規定的雜質限度，以目前審評趨勢來看，各雜質限度推薦以最嚴格的限度來控制。

針對工藝雜質，放行標準和貨架期標準一般來說是一致的。針對有明顯降解趨勢的降解雜質，可以將放行標準收嚴，以確保在穩定性過程中產品有關物質合格。

分析方法的確定

確定雜質的研究思路之后，可以開始技術性地進行方法開發。

1.已有標準和文獻的參考與匯總

于仿制藥而言，對已有標準的研究和分析是很重要的環節。在開發方法之前，應將已有標準和文獻全面匯總分析，推薦列表如下：

2.色譜條件的選擇

首先，這個部分的研究，應基于對各已有標準中有關物質方法的了解。如果各標準中色譜條件完全不同，可分別進行重現。重現過程中主要關注：各雜質組分峰的分離情況、供試品檢出雜質的靈敏度情況、峰型和基線的美觀度、方法的省時省力程度，從中選擇最優方法進行調整和優化。

但，有一點要注意的是，在重現已有標準的時候，一定要多想一想，這個色譜條件是不是已經研究透徹了，是不是真的做到了重現。比如有些進口注冊標準，色譜柱的品牌和類型并未詳細規定，實驗者隨意拿來一根色譜柱使用，峰型不好就將這個方法摒棄了，這是很武斷的，一定要仔細對各項參數進行考察，也許不小心放掉的就是方法開發中的關鍵點。

有時候作為舶來品的國外標準或進口注冊標準是會放些煙霧彈來迷惑當事人的，但是改變它的一些關鍵參數也會帶來風險。比如無故提高供試品濃度，可能會帶來峰型美觀度的下降，雜質的檢出過于靈敏，組分峰間分離度減小，而且這些風險和弊端可能會在日積月累的檢驗過程中日益凸顯，后續再去修改和調整方法，又會浪費人力物力，得不償失。因此，在調整方法時要考慮，是不是各方面都已考察完全，避免給自己后續帶來不必要的麻煩。

在色譜條件優化時，應充分考慮雜質的理化性質和結構特點。比如：極性、酸堿性、溶解度、特征基團，這些特點會在調整色譜條件時給實驗者很多啟示。對色譜條件進行重現和優化之后，有關物質的分析方法就可初步擬定了。

3.檢測波長的確認

選擇檢測波長，可使用PDA檢測器的液相色譜儀，在進行方法確認時，直接提取各雜質定位溶液的紫外吸收光譜而定，當然也可以用紫外光譜儀分別掃描各組分對照品溶液（個人覺得比較麻煩，不推薦）。各雜質在所選波長處均應有較大吸收（有時綜合考慮已有標準所規定的檢測波長）。

4.溶液的配制方式

旨在考察提取的方法、次數、時間等因素。

當供試品穩定性不好或者主成分難以從制劑中提取出來時，應考察超聲、振搖或其他方式，以及處理的時間長短。主成分提取的難易程度取決于主成分在溶劑中的溶解性和制劑工藝，應視情況而選擇應有的方式。若配制原料藥供試品溶液，一般僅考慮溶解性即可。

推薦每種方式平行考察2~3份樣品，評估每種配制方式的雜質個數、單個雜質含量、雜質總量、主成分含量等，確保選定的配制方式可以將供試品提取完全，且提取過程中未發生明顯降解。

提醒：最終選定的配制方式應有一定的耐用性，比如提取時間有小的變動或者換用超聲儀、換用搖擺振蕩器時不會影響樣品的提取程度。還有一些情況下，在片劑或顆粒劑研細過程中，研缽也會吸附主成分，或是產生一些雜質，也許換用投片法可以規避這些問題。

5.溶液的處理方式

主要針對于制劑的供試品溶液，配制后進行離心/過濾處理。

推薦考察如下指標：

同時也要考慮具體操作的可行性。比如一些制劑的緩釋材料會使過濾這個操作變得尤為困難，過濾一個供試品會讓一個小姑娘累到懷疑人生，此時在離心不受影響的前提下，只能推薦采用離心方式進行處理。

6.總結和提示

上文寫出的是一些比較常見的開發過程，當然每個品種有自己的特點，開發過程中要研究的可能會更多。比如有時在不同溶劑中，樣品的穩定性會有所不同，那么溶劑的種類也要進行考察和選擇。比如稱樣量和稀釋體積是否也會對供試品產生影響。各位需全面關注分析方法的各項參數，甚至觀察配制過程中的每一個現象，為方法開發的準確可靠性再添一把柴。畢竟人生已經夠艱難了，能少挖給自己的坑，就少挖一點吧。

方法學預驗證

把預驗證這部分放在方法開發中作為一個標題來撰寫，是想要提示各位，不要開發出一個方法后，就匆忙開展方法學驗證，先進行一些預驗證的試驗也是非常有必要的。

1、強制降解實驗可以幫助補充理論中沒有被分析出來的降解雜質，避免后續穩定性過程中再產生，還要再重復研究一遍。

2、有些雜質，配制和處理方式會影響其回收率結果。

3、對于一些結構不穩定的物質，先期考察室溫和冷藏放置的溶液穩定性，可避免驗證過程中走不必要的彎路。

4、至于耐用性的預驗證，更是不可忽視。