摘要  目的：建立加校正因子的主成分自身對照法測定馬來酸依那普利片有關物質的含量。方法：用辛烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑，以磷酸鹽緩沖溶液（0.01mol·L-1磷酸二氫鉀溶液，用磷酸調 pH值為2.2)-乙腈(75:25)為流動相；檢測波長215nm；柱溫為50℃。測定依那普利拉（雜質Ⅰ）和依那普利雙酮（雜質Ⅱ）相對于依那普利的校正因子，并進行定量分析。結果：各色譜系統中依那普利與相鄰雜質及各已知雜質間分離良好，依那普利和雜質Ⅰ、雜質Ⅱ在0.5～30μg·mL-1濃度范圍內線性關系良好 (r> 0. 999)；雜質Ⅰ、雜質Ⅱ校正因子分別為0.71、0.92；雜質Ⅰ的定量方式以加校正因子的主成分自身對照法為宜，加校正因子的主成分自身對照法和外標法測得結果無顯著性差異。結論：該方法簡便快速，可準確測定馬來酸依那普利片的有關物質。

關鍵詞：馬來酸依那普利片；有關物質；校正因子； 高效液相色譜法

中圖分類號：R921.2    文獻標識碼：A   文章編號：1009-3656（2021）

doi:10.19778/j.chp.2021.00.

Determination of related substances in enalapril maleate tablets with main component self-control method with calibration factor

WEI Kai1，LI Xin2

1. Heilongjiang Timehome Pharmaceutical Co., Ltd., Harbin 150025, China；

2. Harbin Institute for Food and Drug Control, Harbin 150001, China

Abstract Objective: To establish the method of main component self-control with calibration factor to determine the related substances in enalapril maleate tablets. Methods: The test was performed on octyl silane bonded silica gel column with the elution of phosphate buffer solution (pH adjusted to 2.2 with phosphoric acid)-acetonitrile (75:25). The column temperature was 50℃, and the detection wavelength was 215 nm. The calibration factors of enalaprilat (impurity I) and enalapril diketopiperazine (impurity II) related to enalapril were determined, then the quantitative analysis of the impurities was carried out. Results:The resolutions between enalapril and the adjacent peaks as well as the known impurities all met the requirements. The calibration curves of enalapril and impurities I and II were linear in the range of 0. 5-30 μg·mL-1 ( r > 0. 999) . The calibration factors of impurities I and II were 0.71 and 0.92, respectively. The main component self-control method with calibration factor could be used for the quantitative analysis of impurity I. There was no significant difference between the results determined by the external standard method and the main component self-control method with calibration factor. Conclusion:The established method was simple and accurate, and it was suitable for the determination of related substances in enalapril maleate tablets.

Key words：enalapril maleate tablets;related substances; relative calibration factor; HPLC;

依那普利片(Enalapril ) 是臨床上常用于抗高血壓的血管緊張素酶抑制劑。依那普利一般以馬來酸鹽的形式存在，常用劑型為片劑。依那普利的主要降解產物為依那普利拉（enalaprilat)和依那普利二酮哌嗪（enalaprildiketopiperazine）[1]。

依那普利片已收載入BP2018[2]，主成分為馬來酸依那普利，檢測雜質有三個，分別為依那普利拉、依那普利雙酮和其他雜質，采用主成分自身對照法計算總雜質的量，其中依那普利拉的校正因子為0.7，依那普利雙酮無校正因子。馬來酸依那普利片已收載入《中華人民共和國藥典》（以下簡稱《中國藥典》）2015年版[3]和日本藥局方 XVII[4]。《中國藥典》2015年版和日本藥局方 XVII均收載2個已知雜質, 分別為依那普利拉和依那普利雙酮，采用主成分自身對照法計算總雜質的量，均無校正因子。隨著對雜質研究的逐漸深入, 科研人員越來越傾向于對已知雜質采用外標法或加校正因子的主成分自身對照法定量。

1、儀器與試藥

1.1儀器

Agilent1200型高效液相色譜儀，Waters2695-2998型高效液相色譜儀，Thermo U3000型高效液相色譜儀，Mettler XS 105 DU分析天平電子天平，色譜柱Agilent Eclipse Plus C8（4.6mm×150mm，5μm），CAPCELLPAK C8（4.6mm×150mm，5μm），TechMateC8-ST Ⅱ（4.6mm×250mm，5μm）。.

1.2試藥

馬來酸依那普利對照品(100705-201604，含量99.9%)，馬來酸(190015-201302，含量99.7%) ，依那普利拉(100707-201803，含量88.1%)均購自中國食品藥品檢定研究院，依那普利雙酮  (TORONTO RESEARCH CHEMICALS INC，6-BSR-145-1，98%)，馬來酸依那普利片 (企業A，批號014171101，014180301，規格10mg；企業B，批號18032013，規格5mg)，乙腈為色譜純, 其他試劑均為分析純, 水為超純水。

2、分析方法與結果

2.1色譜條件

流動相：磷酸鹽緩沖溶液（0.01mol· L-1磷酸二氫鉀溶液，用磷酸調 pH 值為2.2)-乙腈(75:25)，色譜柱為AgilentEclipse Plus C8（4.6mm×150mm，5μm），檢測波長為215nm，進樣量為20μL，流速為2.0mL· min-1，柱溫為50℃,采集時間為30min。

2.2溶液的制備

2.2.1系統適用性溶液  取馬來酸依那普利及雜質Ⅰ、雜質Ⅱ對照品各10mg，精密稱定，分別置100mL量瓶中，加流動相溶解并稀釋至刻度，搖勻作為對照品儲備液。精密量取上述三種對照品儲備液各2mL, 置同一10mL量瓶中,加流動相稀釋至刻度,搖勻，作為系統適用性試驗溶液。

依那普利峰拖尾因子應小于2.0，馬來酸峰與依那普利拉峰的分離度應符合要求，依那普利拉與依那普利、依那普利雙酮各峰之間的分離度均應不低于4.0。

2.2.2對照品溶液  精密量取馬來酸依那普利及雜質Ⅰ、雜質Ⅱ對照品儲備溶液各2mL，置同一100mL量瓶中，加流動相溶解并稀釋至刻度。

2.2.3供試品溶液   精密稱取本品細粉適量（相當于馬來酸依那普利10mg），置5mL量瓶中，加流動相超聲溶解并稀釋至刻度。

2.2.4 對照溶液  精密量取供試品溶液3mL置100mL量瓶中，加流動相稀釋至刻度，搖勻，即得。2.3線性關系、相對保留時間及校正因子的測定

依次精密量取馬來酸依那普利及雜質Ⅰ、雜質Ⅱ對照品儲備溶液各0.5、1.0、2.0、5.0mL，置同一100mL量瓶中，加流動相稀釋至刻度，搖勻，另依次精密量取三種對照品儲備溶液各1.0、2.0、3.0mL，置同一10mL量瓶中，加流動相稀釋至刻度，搖勻，得到系列標準曲線溶液。精密量取系列標準曲線溶液各20μL，按“2.1”項下色譜條件，進樣，記錄色譜圖，以峰面積積分值為縱坐標(Y)，各對照品溶液的濃度為橫坐標(X)，進行線性回歸，其線性方程見表1。

2.4定量限與檢測限

將混合對照品溶液加流動相逐級稀釋,按“2.1”項下色譜條件測定，以S/N=10求得各組分的定量限，以S/N=3求得各組分的檢測限，結果見表1。

2.5 回收率試驗

取9份已知2種雜質含量的同一批號（批號：014171101）的供試品細粉適量，精密稱定，分別精密加入相當于2種雜質含量的80%、100%與120%的雜質對照品，按“2.2.3”項下方法制備高、中、低3種濃度的溶液，進樣測定。雜質Ⅰ的平均回收率為99.71%（RSD1.8%），雜質Ⅱ的平均回收率為99.71%（RSD1.7%）。

2.6 重復性試驗

取樣品（批號：014171101），按“2.2.3”項下供試品溶液制備方法，平行制備6份供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件進樣，記錄色譜圖，經標準曲線法計算2種雜質含量，雜質Ⅰ、Ⅱ的含量的RSD分別為0.76%、1.39%，表明方法重復性良好。

2.7 精密度試驗

取混合對照品溶液，按“2.1”項下色譜條件連續進樣6次，計算混合對照品溶液中各色譜峰面積，其RSD分別為0.42%、0.72%，表明方法精密度良好。

2.8穩定性試驗

    取樣品溶液（批號：014171101），按“2.2.3”項下方法制備供試品溶液，分別在0、2、4、8、12h進樣測定，測定雜質Ⅰ、Ⅱ峰面積RSD分別為0.22%、1.50%，表明供試品溶液室溫下放置12h內穩定性良好。

2.9專屬性試驗

精密稱取樣品（批號：014171101）適量，共5份（每份相當于馬來酸依那普利10mg），分別置于5mL量瓶中，經1mol·L-1的鹽酸溶液、1 mol·L-1的氫氧化鈉溶液、30%過氧化氫溶液、95℃水浴加熱、4000lx光照處理破壞后進樣測定。結果依那普利與雜質Ⅰ、Ⅱ峰之間互不干擾，且其他降解產物峰與3種成分色譜峰的分離度均符合要求。典型色譜圖見圖3。

A.馬來酸(maleate） B.依那普利（enalapril） C.雜質Ⅰ（impurityⅠ）

D.雜質Ⅱ（impurityⅡ）

圖3專屬性試驗典型色譜圖

Fig.3 The typicalchromatograms of specificity test

2.10雜質相對保留時間與相對校正因子的計算

根據相關參考文獻中校正因子的計算方法[5-7]，本研究確定了各雜質相對于依那普利的校正因子計算方法。以標準曲線各濃度點色譜峰的平均保留時間（tR)計算依那普利各雜質相對于依那普利的相對保留時間（RRT），RRT=tR雜質/tR依那普利.。以依那普利和雜質Ⅰ、雜質Ⅱ的線性方程斜率計算依那普利各雜質相對于依那普利的校正因子（f），f=k依那普利/k雜質，其中k依那普利為依那普利的線性方程斜率，k雜質為依那普利雜質Ⅰ、雜質Ⅱ的線性方程斜率。本研究采用三臺不同品牌的高效液相色譜儀器進行測定，其結果見表2。雜質Ⅰ與雜質Ⅱ的相對校正因子分別為0.71和0.92。雜質Ⅰ的相對校正因子與BP2018中雜質Ⅰ的相對校正因子一致。根據雜質研究相關技術指導原則，為確保雜質測定結果的準確可靠，一般情況下，校正因子在 0.9～1.1 時可不予校正，直接采用不加校正因子的自身對照法定量; 超出該范圍，如采用主成分自身對照法的定量方式，須用校正因子進行校正，即加校正因子的主成分自身對照法,以保證雜質定量的準確性[8-9]。

表2 雜質Ⅰ、雜質Ⅱ 各儀器及各色譜柱下的校正因子

Tab.2 Thecorrection factors for impurity I and impurity II under the different instruments and columnsconditions

2.11樣品測定

取馬來酸依那普利片樣品3批，分別采用標準曲線法和加校正因子的主成分自身對照法測定有關物質中雜質Ⅰ、雜質Ⅱ含量，結果如表3所示。經統計學軟件t檢驗分析，采用加校正因子的主成分自身對照法與標準曲線法的測定結果基本一致。

表3標準曲線法與相對校正因子法測定結果比較(%,n=2)

Tab.3 The comparison of test results obtained with the standardcurve method and relative caliberation factor method

3、討論

依那普利主要降解產物為依那普利拉和依那普利雙酮，對于馬來酸依那普利原料，其本身十分穩定，但是如果其產品控制不當，將特別容易降解產生依那普利拉和依那普利雙酮這兩種雜質，降解產生的依那普利拉口服吸收效果不佳，使得藥品難以發揮藥效，達不到降壓的目的。因此在馬來酸依那普利制劑過程中，對這兩種雜質要予以檢測。

本研究按照《中國藥典》2015年版四部中“藥品質量標準分析方法驗證指導原則”的要求，對依那普利拉（雜質Ⅰ）和依那普利雙酮（雜質Ⅱ）的校正因子進行測定，測定結果與BP2018吻合，提高了定量結果的準確性。本文不僅考慮到了色譜條件的耐用性，還通過使用3種不同品牌的儀器和色譜柱來驗證本方法的儀器系統耐用性.結果不同儀器系統測得的相對保留時間和校正因子都具有較好的重現性，為馬來酸依那普利片的質量控制提供參考，并為現行檢測方法的完善提供了數據支持。

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《中國藥品標準》雜志  2021年  第22卷  第1期

魏凱1，李欣2

1. 黑龍江天宏藥業股份有限公司，哈爾濱 150035；

2. 哈爾濱市食品藥品檢驗中心，哈爾濱150001