導讀：無論國內藥品注冊還是國外藥品注冊，各國藥典都是研發過程中必不可少的工具書，眾采各家之長，合理制定質量標準。

 

黃曲霉毒素被世界衛生組織（WHO）癌癥研究機構劃定為一類天然存在的致癌物，是毒性極強的劇毒物質。黃曲霉毒素主要存在于藥材、谷物、堅果、棉籽以及動物飼料相關的產品中。當人攝入量大時，可發生急性中毒，出現急性肝炎、出血性壞死、肝細胞脂肪變性和膽管增生。當微量持續攝入，可造成慢性中毒，生長障礙，引起纖維性病變，致使纖維組織增生。

 

因此，中國藥典對多種中藥材都要求做黃曲霉素檢查，美國藥典對植源性的藥品也要求檢查黃曲霉毒素。

 

今天我們就詳細介紹中國和美國藥典的黃曲霉毒素測定方法，供各位參考。

 

中國藥典和美國藥典中黃曲霉測定方法和限度比較

 

列表如下：

注：總量為黃曲霉毒素B1（AFB1）、黃曲霉毒素B2（AFB2）、黃曲霉毒素G1（AFG1）和黃曲霉毒素G2（AFG2）的總量。

 

各方法的適用范圍

 

中國藥典的三種方法都可以使用，但當測定結果超出限度時，采用第二法進行確認。

 

而美國藥典首先使用第一法，第一法系統適用性不通過才會使用第二法或第三法。

 

美國藥典方法介紹

 

由于中國藥典較易獲得，本文詳細介紹美國藥典黃曲霉素測定方法。

 

1、第一法（TLC法）

 

該方法用于檢測植物來源的材料中可能存在的AFB1、AFB2、AFG1和AFG2。

 

【醋酸鋅-氯化鋁試劑】取醋酸鋅20g、氯化鋁5g，加水溶解使成100mL。

 

【氯化鈉溶液】取氯化鈉5g至50mL水中。

 

【樣品溶液1】取植物材料200g，粉碎成細粉，精密稱量約50g至帶玻璃塞的燒瓶中，加入甲醇-水（17:3）混合液200mL，機械劇烈振蕩不少于30min，過濾。（注：如果樣品溶液有植物色素干擾，則直接采用【樣品溶液2】制備方法。）

 

棄去初濾液50mL，收集續濾液40mL并轉移到分液漏斗中，加入氯化鈉溶液40mL和溶劑己烷25mL，振搖1min。使各層分離，并將下層水層轉移到第二個分液漏斗中，用二氯甲烷提取水層兩次，每次25mL并振搖1分鐘。每次讓各層分離，分離較低的有機層，合并有機層至125mL錐形瓶中。

 

在水浴上蒸發有機溶劑。將剩余提取物轉移至合適的樣品管中，并在水浴上蒸干。冷卻殘渣。如果殘渣中存在干擾，則按照【樣品溶液2】中的方法進行。否則，將上述殘渣用氯仿-乙腈（9.8:0.2）0.2 mL溶解，必要時用機械方法搖動。

 

【樣品溶液2】取植物材料200g，粉碎成細粉，精密稱量約50g至帶玻璃塞的燒瓶中，加入甲醇-水（17:3）混合液200mL，機械劇烈振蕩不少于30min，過濾。

 

收集濾液100mL，并轉移到250毫升燒杯中。加入醋酸鋅-氯化鋁試劑20mL和水80mL。攪拌并靜置5min。

 

加入5 g合適的助濾劑，如硅藻土，混合，過濾。棄去初濾液50mL，收集續濾液40mL并轉移到分液漏斗中，加入氯化鈉溶液40mL和溶劑己烷25mL，振搖1min。

 

使各層分離，并將下層水層轉移到第二個分液漏斗中，用二氯甲烷提取水層兩次，每次25mL并振搖1分鐘。每次讓各層分離，分離較低的有機層，合并有機層至125mL錐形瓶中。

 

在水浴上蒸發有機溶劑。將剩余提取物轉移至合適的樣品管中，并在水浴上蒸干。冷卻殘渣。

 

清理程序：在10 mm×300 mm色譜管底部放置一個中等孔隙率的燒結玻璃盤或玻璃棉塞。用乙醚-己烷（3:1）制備2 g硅膠的漿液，將漿液倒入柱中，并用5 mL相同的溶劑洗滌，使吸收劑沉淀，并向柱頂部添加一層1.5 g無水硫酸鈉。

 

將上述殘渣溶解于二氯甲烷3 mL中，并轉移至色譜柱。用1 mL二氯甲烷沖洗燒瓶兩次，將沖洗液轉移到柱上，以不超過1mL/min的速率洗脫。

 

依次向柱上添加己烷3mL、乙醚3mL和二氯甲烷3mL；以不超過3mL/min的速率洗脫；并棄去洗脫液。

 

向柱中加入二氯甲烷和丙酮（9:1）6 mL，并以不超過1 mL/min的速率洗脫，最好不借助真空。

 

將洗脫液收集在小瓶中，必要時加入沸騰片，并在水浴上蒸干。將殘余物用氯仿-乙腈（9.8:0.2）0.2 mL溶解，必要時用機械方法搖動。

 

【樣品溶液3】如果殘渣仍然有干擾，則直接采用IAC柱清洗程序：將殘渣用甲醇-水（6:4）5mL溶解，再加入5mL水稀釋，加入到平衡好的IAC柱，用磷酸鹽緩沖鹽溶液10mL沖洗兩次，用甲醇2mL緩慢洗脫，收集洗脫液并用氮氣吹干，將殘渣用乙腈200µl溶解。

 

【磷酸鹽緩沖鹽溶液】在水中制備含有0.138 M氯化鈉和0.0027 M氯化鉀的10 mM磷酸鹽緩沖溶液，并用2 M氫氧化鈉調節至pH為7.4。

 

【黃曲霉毒素對照溶液】用乙腈制備AFB1、AFB2、AFG1和AFG2分別含有2.0、0.50、2.0和0.50µg/mL的混合對照溶液。

 

首先用乙腈制備標示濃度均為10µg/mL的各儲備液，在360nm附近測定最大吸光度，計算公式為：

 

黃曲霉毒素濃度（µg/mL）=（A×Mr×1000）/ε，其中A為吸光度，Mr為分子量，ε為摩爾吸收系數，見下表。

黃曲霉毒素	Mr	溶劑	ε
AFB1	312	乙腈	20700
AFB2	314	乙腈	22500
AFG1	328	乙腈	17600
AFG2	33	乙腈	18900

 

最后，準確量取一定量黃曲霉毒素各儲備液至同一容量瓶，用乙腈稀釋至規定濃度。冰箱儲存，使用前平衡至室溫。

 

【黃曲霉毒素溶液】用乙腈稀釋黃曲霉素對照溶液，使AFB1、AFB2、AFG1和AFG2分別為0.4、0.1、0.4和0.1µg/mL。

 

【測定方法】分別將黃曲霉毒素溶液2.5、5、7.5和10µL以及3次10µL樣品溶液1、樣品溶液2或樣品溶液3，點樣于同一0.25-mm厚度的色譜硅膠TLC板（見色譜法〈621〉）上。并將5µL黃曲霉毒素溶液疊加在三個10µL樣品溶液的其中之一上。斑點晾干，用未飽和的氯仿-丙酮-異丙醇（85:10:5）混合溶劑系統展開，展距不少于15cm。取出，標記溶劑前沿，晾干，于365 nm的紫外光下確定斑點。

 

【系統適用性】黃曲霉毒素溶液顯四個清晰、分離的藍色熒光斑點，樣品溶液如顯斑點，疊加黃曲霉毒素溶液任何斑點的顏色不淺于相應黃曲霉毒素溶液的顏色。

 

【標準】樣品溶液不得檢出與黃曲霉毒素溶液一致的斑點，如果在樣品溶液中檢出黃曲霉毒素斑點，需根據樣品溶液的熒光斑點位置與黃曲霉毒素溶液中的熒光斑點的位置相匹配，以確定供試品中的黃曲霉毒素類型。如果黃曲霉毒素斑點存在于供試品溶液中，當與黃曲霉毒素溶液中相應黃曲霉毒素的強度進行比較時，將得出供試品溶液中黃曲霉毒素的近似濃度。除非另有說明，則AFB1的限值不得超過5 ppb，AFB1、AFB2、AFG1和AFG2的總和不得超過20 ppb。

 

2、第二法（薄層掃描法）

 

【氯化鈉溶液】取氯化鈉5g至50mL水中。

 

【磷酸鹽緩沖鹽溶液】在水中制備含有0.138 M氯化鈉和0.0027 M氯化鉀的10 mM磷酸鹽緩沖溶液，并用2 M氫氧化鈉調節至pH為7.4。

 

【免疫親和柱IAC】平衡之前需將IAC放至室溫，用磷酸鹽緩沖鹽溶液10 mL以2~3mL/min的速率洗脫，加入樣品前需在柱頂端保留0.5mL磷酸鹽緩沖鹽溶液。

 

【樣品溶液】取代表性粉末樣品約5g，準確稱重，轉移至玻璃塞燒瓶中，加入甲醇-水（17:3）20mL，用機械方法用力搖晃30min，過濾。棄去初濾液5mL，收集續濾液4mL。

 

將濾液轉移到分液漏斗中，加入氯化鈉溶液4mL和己烷2.5mL，搖動1min。使各層分離，并將低層的水層轉移至第二個分離漏斗，用二氯甲烷提取水層兩次，每次2.5mL，每次搖動1min。

 

使各層分離，合并低層的有機層至50mL錐形瓶中。在水浴上蒸發有機溶劑。將剩余提取物轉移至合適的樣品管中，水浴上蒸干。冷卻殘渣。

 

如果殘渣中存在干擾，請直接采用IAC柱清理程序，否則，將上述殘渣溶解在200µL乙腈中，必要時用機械方法搖動。

 

【IAC柱清洗程序】將殘渣用甲醇-水（6:4）5mL溶解，再加入5mL水稀釋，加入到平衡好的IAC柱中，用磷酸鹽緩沖鹽溶液10mL沖洗兩次，用甲醇2mL緩慢洗脫，收集洗脫液并用氮氣吹干，將殘渣用乙腈200µL溶解。

 

【黃曲霉毒素溶液】用乙腈稀釋黃曲霉素對照溶液，使AFB1、AFB2、AFG1和AFG2分別為0.04、0.01、0.04和0.01µg/mL。

 

【測定方法】將5、7.5和10µL黃曲霉毒素溶液和3次10µL樣品溶液分別點樣于合適的200µm厚度的色譜硅膠HPTLC板上（見色譜法〈621〉）。并將5µL黃曲霉毒素溶液疊加在三個10µL樣品溶液的其中之一上。

 

斑點晾干，用飽和的氯仿-丙酮-水（140:20:0.3）混合溶劑系統展開，展距不少于72mm。取出，標記溶劑前沿，晾干5min，于365 nm的紫外光下掃描斑點的熒光強度。將供試品溶液的每個熒光點的位置與黃曲霉毒素溶液的熒光點的位置相匹配，以確定存在黃曲霉毒素的類型。樣品溶液中黃曲霉毒素的濃度可根據黃曲霉毒素溶液掃描數據得到的標準曲線計算。

 

【系統適用性】黃曲霉毒素溶液顯四個明顯分離的藍色熒光點。樣品溶液如顯斑點，疊加黃曲霉毒素溶液的任何斑點的顏色不淺于相應黃曲霉毒素溶液的顏色。加標AFB1和AFG1的平均回收率不低于70%。

 

【標準】除非另有說明，則AFB1的限值不得超過5 ppb，AFB1、AFB2、AFG1和AFG2的總和不得超過20 ppb。

 

3、第三法（HPLC-熒光檢測器）

 

【0.1M磷酸鹽緩沖溶液】取無水磷酸氫二鈉（Na2HPO4，分子量141.96）8.69 g、無水磷酸二氫鈉（NaH2PO4，分子量119.98）4.66 g或一水合磷酸二氫鈉（NaH2PO4·H2O，分子量137.99）5.36 g，溶解于800 mL水中，用2 M氫氧化鈉調節至pH 7.4，加入10 mL聚山梨酯20，用水稀釋至1 L。

 

【黃曲霉素工作對照溶液】用甲醇-水（1:1）稀釋黃曲霉素對照溶液，最終濃度見下表。冰箱保存，使用前平衡至室溫，每日新制。

【免疫親和柱IAC】使用含有對AFB1、AFB2、AFG1和AFG2交叉反應的單克隆抗體的IAC。免疫黃曲霉素柱的總黃曲霉毒素最小容量不低于100 ng。將AFB1、AFB2、AFG1和AFG2每個5 ng，溶于10 mL 10%甲醇的磷酸鹽緩沖鹽溶液（v/v）中時，各回收率不低于80%。

 

【樣品溶液】取代表性的樣品5g，置于50mL離心管中，加入氯化鈉1 g和甲醇-0.5%碳酸氫鈉（7:3）25 mL。在渦流混合器上混合，直到樣品顆粒和提取溶劑充分混合。

 

在400 rpm下搖動10min，7000 rpm離心10min，立即用移液管將7 mL移到50 mL離心管中，添加 0.1 M磷酸鹽緩沖溶液28 mL，混合，玻璃纖維濾紙過濾，收集25mL濾液（相當于1g樣品）到25mL刻度量筒中，并立即進行IAC色譜分析。

 

IAC清理：[注：對于IAC柱在使用前必須在室溫下至少保持15分鐘。]從色譜柱上取下頂蓋，并將其與儲液罐連接。從柱上拆下端蓋，并將其連接到柱歧管上（必須擰緊）。讓柱中的液體通過，直到液體高出柱床約2–3 mm。

 

將25毫升液體倒入儲液罐。讓液體在重力作用下流過柱子。讓柱子流干。

 

為了便于再次開始流動，從歧管上取下色譜柱，向色譜柱中加入約2 mL磷酸鹽緩沖鹽溶液，將色譜柱重新連接到儲液罐上，然后用3mL磷酸鹽緩沖鹽溶液和5mL水清洗色譜柱（如果能使用其他技術去除色譜柱末端的氣泡并很容易重新開始流動，則可將5mL磷酸鹽緩沖鹽溶液直接添加到色譜柱儲液罐中）。

 

讓柱子流干，然后用注射器強制注射3mL空氣通過柱子。用1mL甲醇洗脫，并用3mL容量瓶收集分析物，使洗脫液自由滴落。讓柱子流干。

 

靜置1min，然后用額外的1mL甲醇洗脫，并收集在同一容量瓶中。讓柱子流干，并強制10mL空氣通過柱子。用水稀釋洗脫液至刻度，立即進行黃曲霉毒素分析。

 

【系統適用性溶液】向5g樣品中加入5mL工作黃曲霉毒素標準溶液5，重復供試品溶液的程序，用20mL代替25mL甲醇-0.5%碳酸氫鈉（700:300）的混合物，制備加標樣品。

 

【色譜系統】檢測器：熒光，激發波長（Ex）362nm，發射波長（Em）440nm；

 

柱：4.6-mm×15 cm；3-µm填料L1；

 

流速：0.8 mL/min；

 

流動相：等度，用PHRED池進行柱后衍生：水、甲醇和乙腈（60:25:15），對于使用Kobra池的柱后衍生：1 L的水-甲醇-乙腈（60:25:15）的混合溶液、350µL 4 M硝酸和120mg溴化鉀。

 

柱后衍生PCD體系：PHRED池：柱后光化學衍生池；Kobra池：電化學電池，柱后溴化衍生池。

 

【測定方法】柱后衍生黃曲霉毒素：使用UV或Kobra池。試劑空白（黃曲霉毒素工作對照溶液1），黃曲霉毒素工作對照溶液2~6，或樣品溶液各進樣50µL，通過比較樣品溶液與工作溶液的保留時間，確定試驗溶液中的黃曲霉毒素峰。黃曲霉毒素的洗脫順序為AFG2、AFG1、AFB2和AFB1。通過PHRED或Kobra池后，AFG1和AFB1被衍生化形成AFG2a和AFB2a。

 

使用PHRED電池，AFG2、AFG2a、AFB2、AFB2a的保留時間在14到27min之間；使用Kobra池，保留時間更短。峰值應該是基線解析的。建立每種黃曲霉毒素的標準曲線。根據標準曲線測定樣品溶液中每種黃曲霉毒素的濃度。

 

黃曲霉毒素校準曲線：AFB1和AFG1的范圍為0.25~4 ng/mL，AFB2和AFG2的范圍為0.0625~1 ng/mL。如果樣品的響應超出（更高）校準范圍，應使用甲醇-水（1:1，v/v）稀釋樣品溶液，并重新進樣。

 

黃曲霉毒素的定量：通過測量每個黃曲霉毒素保留時間的峰面積并將其與相應的校準曲線進行比較來實現的。

 

【系統適用性】添加AFB（2µg/kg）和黃曲霉毒素（5µg/kg）的平均回收率分別為68%和70%。AFB1和黃曲霉毒素總量的相對標準偏差（RSD）不高于10%。

 

【計算】根據濃度（ng/mL，x軸）繪制每種毒素標準品的峰面積（響應，y軸），并確定斜率（S）和y截距（a）。

 

按以下公式計算樣品中的毒素含量：

 

毒素（µg/kg）={[（R−a）/S]×V/W}×F

 

R=樣品溶液的峰面積；a=校準曲線的y截距；S=校準曲線的斜率；V=樣品溶液的最終體積（mL）；W=通過免疫柱的供試品1g；F=稀釋系數，V=3 mL時為1；黃曲霉毒素的總量是AFG1、AFG2、AFB1和AFB2的總和。

 

【標準】除非另有說明， AFB1的限值不得超過5 ppb，AFB1、AFB2、AFG1和AFG2的總和不得超過20 ppb。