本文適用范圍：主要針對采用高效液相色譜法進行含量含均的檢查，氣相色譜法和紫外-可見分光光譜法由于儀器不同，對結果的要求會有差異，試驗內容基本相同。本文不適用容量法（滴定法）等其他方法。

一、含量方法學驗證前的準備工作

1.開發準備

確保方法開發內容各項足夠全面。即使方法學驗證方案在時間上區分出了開發階段和驗證階段，但在思路上，二者不該有明顯的界限。一個新品種的分析方法，理應足夠準確、靈敏和耐用，可以經過時間和無數批商業化批次樣品的考驗。開發與驗證的全面性和靈活性缺一不可，分析工作或許會貫穿品種的整個生命周期。

2.物質準備

確定好方法學驗證用樣品，準備相關試劑、對照品、色譜柱等消耗品，確認所使用儀器都在校驗有效期內，最后定稿方法學驗證方案。——千百年來，兵馬與糧草的關系，你們都懂的。

3.心理準備

準備好強大的內心，應對突如其來的偏差、真假難辨的誤差、以及千奇百怪的各種問題。對業內人士來說，排名第一的內心獨白是要淡定，排名第二的內心獨白還是要淡定。

二、含量方法學驗證內容

注：該表格為常規實驗概述，特殊情況請自行增減內容。

下面分模塊講解各項試驗內容：

1.專屬性

1.1分離度考察試驗

目的：考察空白溶劑、空白輔料和各雜質與待測組分峰之間的分離情況。

空白溶劑、對照品溶液、供試品溶液：按擬定標準配制。

空白輔料溶液：空白輔料按處方比例混合后，按擬定標準配制。

各已知雜質定位溶液：沒有明確規定，在配制濃度下雜質峰可見即可。勿配太大或太小，太大峰型過寬，不利于定位保留時間；太小在量程下看不到雜質峰，無法歸屬。

有時可配制雜質混合溶液，用來排除雜質干擾。再配制加入主成分（主成分待測濃度）和各雜質的混合溶液，確定主成分與相鄰雜質的分離度——兩針搞定，無需進針分析各雜質定位溶液。

1.2強制降解試驗

目的：考察降解生成的雜質與主成分峰之間的分離情況，同時可以大致了解樣品在各降解條件下的穩定性情況。

對于含量測定的強制降解試驗，我們一般不需要知道降解所產生的雜質究竟是誰，只要確定降解雜質不影響主成分的測定即可。

同樣的，主峰峰純度也是要關注的。看主峰中是否包含其他組分峰。

降解試驗條件要適度，降解程度盡量不低于80%，若條件足夠劇烈，供試品仍未降解產生雜質，無需再提高降解條件的劇烈程度進行重復試驗。

注意：若分析方法為等度洗脫，降解試驗的采集時間應適當延長，避免降解產生的雜質未洗脫出來而影響下一針分析。

2.溶液穩定性

目的：考察對照品溶液和供試品溶液配制后的穩定時間，為工藝驗證、批檢驗、穩定性考察以及上市后的含量測定提供依據。

系統適用性溶液視情況考察，對照品溶液與供試品溶液必須考察。

應先考察室溫下的溶液穩定性，若不穩定，則應逐一排除，找出不穩定的原因（光、熱、析出等原因），然后再重復考察避光條件或冷藏條件下是否穩定。若仍然不穩定，可考慮更換溶劑、更換流動相系統等方法。如無法解決樣品不穩定的問題，則質量標準需規定供試品臨用現配。

注意：溶液穩定性的考察時間也應針對具體情況，如采集時間較長，考察時間也應延長，目的是使后續檢驗更方便。

3.定量限

目的：為確保分析方法測定供試品含量的靈敏度。

定量限的概念：是指樣品中被測物能被定量測定的最低量，其測定結果應具有一定的準確度。定量限體現了分析方法是否具備靈敏的定量檢測能力。

將對照品溶液逐級稀釋，當稀釋至信噪比約為10時，此時濃度可作為定量限濃度。

含量測定并不強制要求做檢測限。

注意：定量限結果受色譜系統影響較大，如色譜柱、流動相、色譜儀的狀態，甚至次日試驗的結果會與前一天不同，在這種情況下，若定量限濃度較低，應換用色譜系統再次測定，以確保方法的靈敏度。

4.線性與范圍

目的：在規定的濃度范圍內，測定響應值（峰面積）與待測組分濃度呈比例關系的程度。

敲黑板——峰面積與濃度呈線性關系，是外標法的前提。

配制一份對照品母液，從中稀釋配制成一系列不同濃度的線性溶液，至少制備5份（建議濃度點的總數為奇數），以測得的響應信號對待測物的濃度作圖，檢查是否呈良好的線性關系。

含量測定線性范圍應至少為80%~120%或更寬，含量均勻度線性范圍應至少為70%~130%或更寬，線性的濃度范圍理應涵蓋回收率考察的濃度范圍，但注意濃度最低點應高于定量限濃度。

附一張推薦的數據結果表格與線性關系圖如下：

5.精密度

5.1儀器精密度

目的：為保證儀器每次所測對照品溶液峰面積均一致，以確保含量測定結果的準確性，設計儀器精密度試驗。

取對照品溶液，連續進樣6次。考察保留時間和峰面積的RSD%。

5.2重復性

目的：考察六次取樣測定所得結果之間的接近程度。

按照擬定標準配制空白溶劑、對照品溶液和6份供試品溶液（系統適用性溶液視情況配制），計算6份供試品溶液的含量，計算平均值并統計6份結果的RSD值。

2015年版中國藥典關于重復性的可接受范圍截圖如下：     

5.3中間精密度

目的：考察在同一實驗室，不同時間，由不同人員用不同設備測定結果之間的接近程度。

溶液配制與實驗要求同重復性。

6.準確度

目的：考察采用擬定方法測定結果與真實值或參考值接近的程度，也叫做回收率試驗。用至少測定6份結果進行評價，或設計3種不同濃度，每個濃度平行配制3份。

按照擬定質量標準配制空白溶劑、對照品溶液。

回收率供試品溶液：按處方比例混合的空白輔料+主成分對照品，再按照擬定質量標準配制溶液。

僅做含量測定，推薦濃度為80%、100%、120%。

做含量均勻度，推薦濃度為70%、100%、130%。

2015年版中國藥典關于回收率的可接受范圍截圖如下：

7.耐用性

目的：考察色譜條件發生微小變化時對含量測定結果的影響。

按照擬定標準配制空白溶劑、對照品溶液和供試品溶液（系統適用性溶液視情況配制），計算不同條件下供試品的含量測定結果，關注系統適用性是否符合標準要求（有時含量測定的方法中并不擬定配制系統適用性溶液，而是規定主峰理論板數和拖尾因子等，也要相應關注和統計。）。

同樣放一張表格，將耐用性試驗內容和結果要求直觀呈現如下：

耐用性考察的內容可能還有很多，請各位根據實際情況增減。另外，有時幾個條件同時變化的情況下是否耐用，也是需要考察的。但考察疊加條件工作量較大，可自行選擇較為重要的條件進行考察。耐用性試驗時，觀察峰型和結果的變化趨勢，后續檢驗一旦出現問題，可以通過現象推測偏差原因，及時解決問題。

注意：變化不同色譜條件時，切記根據需要延長采集時間。

做完以上這些內容，各項結果均合格，就可以皆大歡喜去轉移方法了。如果哪一項出現問題，建議先進行復測（必要時，換人換儀器進行復測），先找出問題所在，再行調整方法。

三、總結和提示

1.目前藥品研發企業對時間的觀念可謂超強，申報時間延誤不得，在這種大環境下，合理安排實驗時間至關重要。每天實驗之前多想想，是否有多個實驗的對照品溶液是可共用的，是否有多個實驗是可以同時開展進行的。統籌規劃，可以為你節省很多時間和精力，以及，買對照品的錢。

2.有時容易被忽略掉的，是中間產品的含量測定方法。我們通常習慣于直接采用成品的含量測定方法進行中間產品的控制，然而總混顆粒跟片劑的性質仍然有差異，有時會出現方法并不適用的情況，比如中間產品重復性不好，比如研磨時出現吸附現象，比如有時成品含量測定稱樣量較大而中間產品則可相應減小稱樣量。在方法驗證前期注意到這些細節，及時進行考察，避免測定時才發現問題，會更加被動。