摘要：
目的：分別建立羌活與寬葉羌活的GC指紋圖譜、HPLC指紋圖譜，為羌活的揮發性及非揮發性成分質量評價與控制提供有效可靠方法。
方法：采用GC、HPLC色譜法分別建立羌活與寬葉羌活的指紋圖譜，通過相似度評價軟件，綜合GC、HPLC指紋圖譜相似度結果對222批樣品的揮發性及非揮發性成分進行質量分析。結果：建立的GC指紋圖譜結果顯示，羌活共有峰有10個，寬葉羌活共有峰有12個，二者共有成分有9個。HPLC指紋圖譜結果顯示，羌活共有峰有9個，寬葉羌活共有峰有7個，二者共有成分6個。其中，羌活醇與異歐前胡素在羌活和寬葉羌活中的含量存在明顯差異。GC和HPLC指紋圖譜結果均顯示，222批樣品中有7批偽品，有21批寬葉羌活樣品，有118批羌活樣品，有76批含有兩種基原羌活的樣品，二者結果一致。
結論：建立的氣相及液相指紋圖譜能有效區分羌活的基原與真偽，并能夠有效表征藥材的質量優劣，可為羌活的整體質量評價及控制提供依據。
羌活為傘形科植物羌活(Notopterygium inchum Ting ex H, T- Chang)或寬葉羌活(Notopterygium franchetii H. de Boiss)的干燥根及根莖, 功效有解表散寒、祛風除濕、通痹止痛, 是治療四時風寒濕痹的要藥, 臨床多用于風寒感冒、頭痛項強、風濕痹痛和肩背酸痛[1]。自1995年, 羌活野生資源含量呈急劇下降的趨勢, 其市場價格大幅增長。在利益的驅動下, 摻假、以次充好的現象日益普遍[2]。所以, 如何能更加有效控制羌活質量就顯得尤為重要。
中藥指紋圖譜可在整體層面反映中藥內在的化學成分種類及其數量, 能有效地表征中藥質量, 在評價中藥真偽優劣、區分物種和確保其一致性和穩定性方面發揮著強有力的作用[3]。液相指紋圖譜普遍用于中藥非揮發性成分的質量控制及評價。對于中藥材及中藥制劑中的揮發性成分, 主要采用氣相色譜指紋圖譜實現其質量鑒定及控制[4]。羌活中主要有效成分有揮發性成分及非揮發性成分兩大類[5], 故筆者采用GC/HPLC指紋圖譜綜合分析羌活質量, 以期為羌活整體的質量評價提供參考。
1 儀器與試藥
1.1 儀器與試劑
Agilent 7890A氣相色譜儀, FID檢測器, Agilent DB-5(30 m×0.32 mm, 0.25μm)石英毛細管色譜柱; Agilent 6890N-5975B氣質聯用儀, Agilent DB-5MS(30 m×0.25 mm, 0.25μm); Agilent 1260高效液相色譜儀, DAD檢測器, AGELA C18柱(250 mm×4.6 mm, 5μm); 電子恒溫加熱套, 純化水, 乙腈(色譜純), 甲醇(分析純, 國藥集團化學試劑有限公司)。
1.2 藥材及飲片
全國市售羌活共抽檢202批次(編號C1~C202), 涉及生產企業、經營單位和使用單位三種來源, 自行收集的非抽檢羌活樣品及其偽品(表 1)20批(編號W1~W20), 共計222批。
表 1 羌活樣品及其偽品收集表
2 方法與結果
2.1 GC指紋圖譜
2.1.1 GC供試品溶液的制備
取樣品粉末(過三號篩)約50g, 稱定重量(準確至0.01 g), 置1000 mL圓底燒瓶中, 加純化水約400 mL, 浸泡10 min, 水蒸氣蒸餾法提取揮發油約5 h, 冷卻后讀數, 記錄。將所得揮發油溶于1mL乙酸乙酯中, 即得供試品儲備液。精密移取供試品儲備液150 μL, 稀釋10倍即得供試品溶液。
2.1.2 GC指紋圖譜分析條件
GC條件:Agilent 7890A氣相色譜儀, 氫火焰檢測器(FID), Agilent DB-5(30 m×0.32 mm, 0.25μm)石英毛細管色譜柱, 程序升溫, 柱初始溫度為50℃, 以1.5℃·min-1的速率升至130℃, 再以1℃·min-1的速率升至150℃, 再以10℃·min-1的速率升至240℃, 保持10 min。檢測時間為92 min, 檢測器溫度為280℃, 進樣口溫度為260℃, 進樣量為1.0μL, 載氣為氮氣, 分流比為5:1。
GC-MS條件:Agilent 6890N-5975B氣質聯用儀, Agilent DB-5MS(30 m×0.25 mm, 0.25μm)調諧方式為自動調諧, 電離方式為EI, 電子能量為70 ev, 離子源溫度為230℃, 四級桿溫度為150℃, 程序升溫, 升溫梯度同GC條件, 數據采集掃描模式為離子檢測+全掃描, 溶劑延遲時間為3 min, 載氣為氦氣, 分流比50:1。
2.1.3 方法學考察
1) 精密度:取A178號藥材樣品按"2.1.1"節方法制備供試品, 并按"2.1.2"節色譜條件連續測定6次, 測得各色譜圖, 采用《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統2.0版》計算相似度, 結果6次進樣的相似度均大于0.978, RSD值為0.04%, 表明本試驗建立的GC方法精密度良好。
2) 重復性試驗:取A178號藥材樣品6份, 按"2.1.1"節方法平行制備, 按"2.1.2"節色譜條件測定, 測得各色譜圖, 采用《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統2.0版》計算相似度, 結果樣品的相似度均大于0.970, RSD值為0.32%, 表明本試驗建立的GC方法精密度良好。
3) 穩定性試驗:取A178號樣品按"2.1.1"節方法制備供試品, 置室溫條件下, 按"2.1.2"節色譜條件分別于0、3、6、12、24 h進行測定, 測得各時間段色譜圖, 采用《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統2.0版》計算相似度, 結果均大于0.978, RSD值為0.04%, 表明按"2.1.1"節制備的供試品溶液于24 h內保持穩定。
2.1.4 GC指紋圖譜共有模式的建立
分別選取222批樣品中質量中等且基原準確的21批次羌活藥材(其中外來收集樣品3批)和17批基原準確的寬葉羌活藥材(其中外來收集樣品1批), 粉碎過三號篩, 按照GC供試品溶液的制備方法制備供試品, 按照"2.1.2"節GC色譜條件進行測定, 分別將樣品的氣相指紋圖譜數據導入《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統2.0版》中, 得到的羌活與寬葉羌活氣相指紋圖譜共有模式顯示, 二者分別確定10個、12個共有峰, 其揮發油氣相指紋圖譜共有模式分別見圖 1(羌活)和圖 2(寬葉羌活)。
圖 1 羌活GC指紋圖譜共有模式
圖 2 寬葉羌活GC指紋圖譜共有模式
對比羌活與寬葉羌活GC指紋圖譜可知, 1、2、3、4、5、7、8、10、13號峰為共有峰, 6、9、11號峰為寬葉羌活特有成分, 12號峰為羌活獨有成分。
2.1.5 羌活與寬葉羌活揮發油成分的GC-MS分析
取W1~W20樣品, 按照"2.1.2"節方法進行GC-MS分析, 采用NIST05a質譜數據庫系統檢索并參考相關文獻資料[6-7], 指認各共有峰, 結果見表 2。
表 2 羌活與寬葉羌活揮發油化學成分
2.1.6 偽品GC指紋圖譜分析
7批偽品與羌活及寬葉羌活GC對照指紋圖譜疊加圖見圖 3, 從上至下依次是羌活對照指紋圖譜、寬葉羌活對照指紋圖譜、獨活、云南羌活、歐洲前胡、禹州漏蘆、歐當歸、黑水當歸、朝鮮當歸。結果顯示偽品揮發油中與羌活揮發油中的共有成分相似。其中, 黑水當歸、朝鮮當歸在76.2 min與45.1 min處均無峰; 歐當歸在45.1 min與49.9 min處無峰, 且在38.3 min及80.8 min處的峰異常高, 偽品氣相指紋圖譜與羌活及寬葉羌活共有模式均不一致, 相似度為0。故本試驗建立的羌活GC指紋圖譜與寬葉羌活指紋圖譜均能有效鑒別羌活的混偽品。
圖 3 羌活對照與偽品氣相指紋圖譜
2.2 HPLC指紋圖譜
2.2.1 HPLC供試品溶液的制備
采用四分法均勻取羌活飲片約100 g, 粉碎使過三號篩, 過篩粉末混勻后精密稱取約0.4 g, 置錐形瓶中, 精密加入甲醇50 mL, 稱定重量, 超聲處理30 min, 放冷, 用甲醇補足損失的重量, 搖勻, 濾過, 取續濾液過微孔濾膜(0.45 um), 即得[1]。
2.2.2 HPLC指紋圖譜分析條件
色譜柱為AGELA C18柱(250 mm×4.6 mm, 5μm), 以乙腈為流動相A, 以0.1%磷酸水為流動相B, 按表 3的梯度洗脫程序進行洗脫, 流速為1.0 mL·min-1, 柱溫為25℃, 檢測波長為310 nm。
表 3 HPLC色譜條件梯度洗脫表
2.2.3 方法學考察
1) 精密度:取A178樣品按"2.2.1"節方法制備供試品, 并按"2.2.2"節色譜條件連續測定6次, 測得各色譜圖, 采用《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統2.0版》計算相似度, 結果6次進樣的相似度均不低于0.954~0.956, RSD值為0.08%, 表明本試驗建立的HPLC方法精密度良好。
2) 重現性試驗:取A 1 7 8號樣品6份, 按"2.2.1"節方法平行制備, 按"2.2.2"節色譜條件測定, 將測得的各色譜圖導入《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統2.0版》計算其相似度, 結果樣品的相似度均在0.952~0.957, RSD值為0.18%, 表明本試驗建立的HPLC方法精密度良好。
3) 穩定性試驗:取A178號樣品按"2.2.1"節方法制備供試品, 置室溫條件下, 按"2.2.2"節色譜條件分別于0、3、6、12、24 h進行測定, 測得各時間段的色譜圖, 將其導入《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統2.0版》計算相似度, 結果在0.954 ~0.957, RSD值為0.14%, 表明供試品溶液至少于24 h內保持穩定。
2.2.4 HPLC指紋圖譜共有模式的建立
選取222批樣品中質量中等的14批羌活藥材和15批寬葉羌活藥材(其中寬葉羌活對照藥材1批), 粉碎過三號篩, 按HPLC供試品制備方法制備供試品, 并按照"2.2.2"節色譜條件進行測定, 經《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統2.0版》處理, 結果顯示羌活HPLC共有模式確定有9個共有峰, 寬葉羌活確定有7個共有峰, 獲得的對照指紋圖譜分別見圖 4(羌活)及圖 5(寬葉羌活)。
圖 4 羌活HPLC指紋圖譜共有模式
圖 5 寬葉羌活HPLC指紋圖譜共有模式
對比羌活與寬葉羌活的HPLC指紋圖譜, 發現羌活與寬葉羌活共有的成分為1(5.6 min)、2 (10.6 min)、3(11.9 min)、4(13.6 min)、6 (47.6 min)、8(52.8 min)號峰, 其中, 羌活中6號峰(羌活醇)的含量與8號峰(異歐前胡素)含量的比值大于等于1, 而在寬葉羌活中則遠遠小于1。此外, 羌活中7(49.5 min)、9(58.3 min)、10(60.4 min)號峰穩定存在, 且含量高于寬葉羌活, 而在寬葉羌活中含量普遍偏低, 或低于檢出限。寬葉羌活中5(20.9 min)號峰穩定存在。
2.2.5 偽品HPLC指紋圖譜分析
7批偽品與羌活及寬葉羌活HPLC對照指紋圖譜疊加圖見圖 6, 從下至上依次是羌活HPLC對照指紋圖譜(R1)、寬葉羌活HPLC對照指紋圖譜(R2)、朝鮮當歸(S1)、黑水當歸(S2)、歐當歸(S3)、歐洲前胡(S4)、禹州漏蘆(S5)、云南羌活(S6)、獨活(S7)。結果顯示與R1、R2比較, S1、S2在42 min、44.5 min、45.1 min峰異常高, 在52 min~54 min峰比較集中; S3中50.2 min峰異常高; S4缺失5.6 min峰, 27 min明顯出峰, 51.5 min峰異常高; S5、S6中11.9 min峰很弱, 40 min后出峰很少; S7在10.9 min、11.9 min處無峰, 在26 min~30 min范圍內出峰較多, 47.8 min處無峰出現。偽品HPLC指紋圖譜與R1、R2差異較大。
圖 6 羌活對照與偽品液相指紋圖譜
3 討論
3.1 關于羌活與寬葉羌活揮發性成分的差異分析
對比寬葉羌活與羌活的G C共有模式指紋圖譜發現, 前者的特有成分有3, 7 - d i m e t h y l - 1, 3, 6-Octatriene(3, 7-二甲基-1, 3, 6-辛三烯)、2-methoxy-4-methyl-1-(1-methylethyl)-Benzene (2-甲氧基-4-甲基-1-異丙基苯)、Cyclooctene (環辛烯), 后者的特有成分為Aromadendrene oxide(香橙烯氧化物), 二者的共有峰有9個。其中羌活中1-methyl-3-(1-methylethyl)-Benzene (1-甲基-3-異丙基苯)的含量低于D-Limonene (D-檸檬烯), 而在寬葉羌活中則相反。二者的G C共有模式指紋圖譜可區分兩種基原的羌活。在對2 0 2批樣品進行相似度評價時發現有的樣品與羌活和寬葉羌活的相似度均不為0, 即均有3, 7-dimethyl-1, 3, 6-Octatriene(3, 7-二甲基-1, 3-6-辛三烯)、2-methoxy-4-methyl-1-(1- methylethyl)- Benzene(2-甲氧基-4-甲基-1-異丙基苯)、Cyclooctene(環辛烯)及Aromadendrene oxide(香橙烯氧化物), 推斷可能是羌活樣品中摻有寬葉羌活。
3.2 關于羌活與寬葉羌活非揮發性成分的差異分析
對比羌活與寬葉羌活的HPLC共有模式指紋圖譜發現, 二者HPLC指紋圖譜中峰面積超過2%的共有峰有6個, 其中羌活中6號峰的含量與8號峰含量的比值大于等于1。此外, HPLC指紋圖譜顯示, 7、9、10號峰在羌活中穩定存在, 且含量高于寬葉羌活, 而在寬葉羌活中含量普遍偏低, 或接近檢出限。5號峰在寬葉羌活中穩定存在, 寬葉羌活中5號峰普遍高于羌活。羌活與寬葉羌活的非揮發性成分存在差異, 本試驗建立的HPLC共有模式可實現對羌活基原的區分。
3.3 關于區分樣品基原的指紋圖譜相似度評價結果分析
GC指紋圖譜相似度結果顯示, 222批樣品中有7批偽品, 有21批寬葉羌活樣品, 有118批羌活樣品, 有76批含有兩種基原羌活的樣品, 與HPLC指紋圖譜的相似度評價結果一致, 表明試驗所建立的羌活氣相及液相指紋圖譜對于222批樣品基原區分的結果一致, 二者可相互驗證, 建立的指紋圖譜具有合理性, 且均可用于羌活基原的鑒別。
3.4 關于羌活質量優劣的指紋圖譜相似度評價結果分析
以0.85為限度, 僅GC指紋圖譜相似度低于0.85的有13批, 僅HPLC指紋圖譜相似度低于0.85的有10批, 二者相似度均低于0.85的有5批, 整體不合格有28批, 不合格率為13%。試驗所建立的指紋圖譜可用于羌活的質量評價。
3.5 關于羌活偽品的指紋圖譜結果分析
本試驗建立的羌活共有模式指紋圖譜與其偽品的氣相及液相指紋圖譜差異較大, 故可有效區分羌活的正品與偽品。其中, 在偽品歐當歸的氣相指紋圖譜中, 38.3 min及80.8 min峰異常高, 在正品羌活中無該位置的峰, 經GC-MS進一步分析確認, 該峰分別為pentyl-Benzene(戊基苯)、1-methylbutyl-Benzene(1-異戊基苯), 故可通過觀察羌活揮發油樣品中38.3min及80.8min位置附近是否有異常峰, 判斷樣品中是否摻有偽品歐當歸。
綜上所述, 羌活與寬葉羌活的成分存在一定差異, 建立單一的指紋圖譜無法從整體上有效評價羌活與寬葉羌活的質量, 故本次試驗分別建立羌活與寬葉羌活的GC及HPLC指紋圖譜, 對于進一步推動羌活質量標準的改進, 實現對藥用羌活內在質量的綜合評價和整體物質的全面控制具有一定意義。
