一、目的與要求：

掌握微量凱氏法測定蛋白質(zhì)總氮量的原理及操作技術(shù)。包括樣品的消化，蒸餾吸收及滴定與含氮量的計算。

 二、原理：

凱氏定氮法：食品經(jīng)加硫酸消化使蛋白質(zhì)分解，其中氮素與硫酸化合成硫酸銨。然后加堿蒸餾使氨游離，用硼酸液吸收后，再用鹽酸或硫酸滴定根據(jù)鹽酸消耗量，再乘以一定的數(shù)值即為蛋白含量，其化學(xué)反應(yīng)式如下。

(1)2NH2(CH2)2COOH+13H2S04   

(NH4)2S04+6C02+12S02+  16H2

(2)(NH4)2SO4+2NAOH-----2NH2+2H2O+NA2SO4

(3)2NH3+4H3BO3----(NH4)2B4O7+5H2O

(4)(NH4)2B407+H2S04+5H20-(NH4)9SO4+4H2BO2

三、試劑與儀器：

1.硫酸鉀

2.硫酸銅   

3.硫酸

4.2％硼酸溶液

5.40％氫氧化鈉溶液

6.混合指示劑：把溶解于95％乙醇的0.l％溴甲酚綠溶液10毫升和溶于95％乙醇的0.l％甲基紅溶液2毫升混合而成

7.0.01NHCL標(biāo)準(zhǔn)溶液或0.01N硫酸標(biāo)準(zhǔn)溶液

8.凱氏微量定氮儀一套

9.定氮瓶100ml或50ml一只

10.三角瓶150ml 3只

11.量筒50ml、10ml、100ml

12.吸量管10ml只

13.酸式滴定管1支

14.容量瓶100毫升1只

15.漏斗1只

四、操作方法

1.樣品處理：精密稱取0.2-2.0g固體樣品或2-5g半固體樣品或吸取10-20ml液體樣品（約相當(dāng)?shù)?0-40mg），移入干燥的100ml或500ml定氮瓶中，加入0.2g硫酸銅，3g硫酸鉀及20ml硫酸，稍搖勻后于瓶口放一小漏斗，將瓶以45度角斜支于有小孔的石棉網(wǎng)上，小火加熱，待內(nèi)容物全部碳化，泡沫完全停止后，加強火力，并保持瓶內(nèi)液體微沸，至液體呈藍(lán)綠色澄清透明后，再繼續(xù)加熱0.5小時。取下放冷，小心加20ml水，放冷后，移入100ml容量瓶中，并用少量水洗定氮瓶，洗液并入容量瓶中，再加水至刻度，混勻備用。

取與處理樣品相同量的硫酸銅、硫酸鉀、硫酸銨同一方法做試劑空白試驗。

2.按圖裝好定氮裝置，于水蒸氣發(fā)生器內(nèi)裝水約2/3處加甲基紅指示劑數(shù)滴及數(shù)毫升硫酸，以保持水呈酸性，加入數(shù)粒玻璃珠以防暴沸，用調(diào)壓器控制，加熱煮沸水蒸氣發(fā)生瓶內(nèi)的水。

3.向接收瓶內(nèi)加入10ml 2%硼酸溶液及混合指示劑1滴，并使冷凝管的下端插入液面下，吸取10.0ml樣品消化液由小玻璃杯流入反應(yīng)室，并以10ml水洗滌小燒杯使流入反應(yīng)室內(nèi)，塞緊小玻璃杯的棒狀玻璃塞。將10ml 40%氫氧化鈉溶液倒入小玻璃杯，提起玻璃塞使其緩慢流入反應(yīng)室，立即將玻璃蓋塞緊，并加水于小玻璃杯以防漏氣。夾緊螺旋夾，開始蒸餾，蒸氣通入反應(yīng)室使氨通過冷凝管而進(jìn)入接收瓶內(nèi)，蒸餾5min。移動接收瓶，使冷凝管下端離開液皿，再蒸餾1min，然后用少量水沖洗冷凝管下端外部。取下接收瓶，以0.01N硫酸或0.01N鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液定至灰色或藍(lán)紫色為終點。同時吸取10.0ml試劑空白消化液按3操作。

計算：

X =【（V1-V2）*N*0.014)/( m*（10/100）)】+F*100　

X：樣品中蛋白質(zhì)的含量，g；

V1：樣品消耗硫酸或鹽酸標(biāo)準(zhǔn)液的體積，ml；

V2：試劑空白消耗硫酸或鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液的體積，ml；

N：硫酸或鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液的當(dāng)量濃度；

0.014：1N硫酸或鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液1ml相當(dāng)于氮克數(shù)；

m：樣品的質(zhì)量（體積），g（ml）；

F：氮換算為蛋白質(zhì)的系數(shù)。