雜質是藥品的關鍵質量屬性，是藥品的安全性、有效性、質量可控性的重要保障。因此，雜質研究是藥品研發的重點內容，絕大部分發補意見中都包括雜質研究問題。雜質限度制定不合理、方法驗證不全面、分析方法的科學性等均是發補常見內容，本文將重點闡述分析方法制定方面的常見發補意見及研究思路，供同行參考。

01 對照溶液濃度與雜質限度不匹配 

發補意見：檢查方法的自身對照溶液濃度過高，與其他單個雜質的限度不匹配，建議降低對照溶液濃度，或者增加靈敏度試驗。

解讀：

根據《中國藥典》2020年版9102《藥品雜質分析指導原則》，對于化學藥品，制劑中未知雜質的控制限度通常為0.2%或更低。藥典多數品種采用自身對照法計算雜質含量，為保證檢測結果的準確性，通常待測物濃度應與對照濃度接近，當對照溶液濃度與雜質限度或檢出值差異過大時，易造成結果失準?！秶宜幤窐藴使ぷ魇謨浴分赋觯簩φ杖芤簼舛葢斒箤φ杖芤褐鞣宓姆迕娣e與所關注主要雜質的量正好為雜質限度時的峰面積相當。

然而，藥典中多數品種的對照溶液濃度為1%，即供試品溶液稀釋100倍，與其他單個雜質限度相差較大，此時建議降低對照溶液濃度。當特定雜質限度與其他單個雜質限度差異較大時，亦可設計多個不同濃度的對照溶液。例如，EP11頭孢西丁鈉質量標準，分別配制對照溶液（a）（濃度為1%）和對照溶液（b）（濃度為0.05%，忽略限），其中對照溶液（a）用于計算特定雜質的含量，對照溶液（b）則用于計算其他單個雜質含量，同時可作為靈敏度溶液。

02 未對自擬方法與藥典方法進行對比 

發補意見：請采用雜質對照品或適度降解樣品，比較自擬方法與《中國藥典》2020年版方法對雜質的檢出和分離能力，選擇更佳的有關物質檢測方法。

解讀：

《化學藥品3類注冊申請藥學自評估報告（制劑）（征求意見稿）》指出：對于已有藥典標準收載的，應分析藥典標準分析方法的適用性；如適用，列表對比自擬方法與藥典方法檢出能力（建議采用影響因素試驗樣品或加速、合理設計降解等），自擬方法的分離檢出能力應不低于藥典標準。

03 物料不守恒 

發補意見：本品穩定性試驗數據顯示，含量下降幅度與有關物質增幅不匹配，請對本品的主要降解途徑和降解產物進行文獻檢索和研究分析，并重新評估本品有關物質檢查方法的分離和檢出能力。

解讀：

物料守恒是有關物質研究中常見的棘手問題，穩定性考察期間如雜質增加與含量下降不匹配，應基于主成分結構特點、文獻資料以及研究數據分析潛在的降解途徑和降解產物，關注分析方法的專屬性、靈敏度、檢出能力、雜質校正因子等的影響，必要時優化分析方法。造成物料不守恒的主要原因如下，可圍繞這幾點開展研究。

（1）洗脫梯度不合理，雜質仍殘留在色譜柱上未被洗脫，可通過延長運行時間或增強洗脫梯度等方法驗證。

（2）降解產物與主峰共洗脫，可采用DAD光譜純度或LC-MS法進一步確證，或調整洗脫梯度觀察主峰前后是否出現新增雜質。

（3）檢測器無法檢出所有降解產物，例如應用紫外檢測器但降解物無紫外吸收，此時應開發另一種方法對該類雜質進行控制，例如注射用鹽酸頭孢吡肟質量標準中除有關物質檢查外，還增加了N-甲基吡咯烷（無紫外吸收）檢查項。

（4）方法靈敏度不足或色譜體系不當導致未能有效識別雜質，這些雜質被當成基線波動、基線抬高等，可通過提高進樣濃度、使用陡梯度HPLC法等進行研究。

（5）雜質響應差異導致定量不準確，當降解產物的結構與主成分差異較大時，其在色譜體系中的響應可能與主成分存在較大差異，應對主要降解雜質的校正因子進行研究，必要時代入校正因子計算雜質含量。

04 雜質定量方法選擇依據不足 

發補意見：請采用限度濃度加標供試品溶液考察外標法、主成分對照法、加校正因子的自身對照法的定量差異，合理制定雜質的定量方法。

解讀：

雜質含量計算方法的選擇作為分析方法開發的重要內容，往往容易被忽略，發補意見要求申請人對不同的定量方法進行比較，其主要目的是對校正因子的準確性進行驗證，確保擬定的定量方法準確可靠。CDE電子刊物《HPLC法校正因子研究中的幾個問題》指出：研究數據應包括雜質對照品外標法、加校正因子的主成分自身對照法、不加校正因子的主成分自身對照法對相同多批樣品雜質定量測定結果的對比數據，作為是否需要校正或能否有效校正檢測結果的支持與依據。

一般地，雜質定量方法主要包括峰面積歸一化法、雜質外標法、主成分外標法、自身對照法，其中主成分外標法和自身對照法又包括加校正因子與不加校正因子兩種方法。峰面積歸一化法由于誤差較大，其應用范圍有限；雜質外標法檢測成本高，一般不作為優選方法，除非雜質的響應與主成分差異過大，即校正因子超出0.2~5.0范圍；主成分外標法和自身對照法兼顧了便利性和準確性，是當前主流的雜質定量方法。在建立方法時，應參考發補意見對不同的定量方法進行比較，選擇與雜質外標法檢測結果基本一致的定量方法。

05 關注相對保留時間耐用性 

發補意見：本品特定雜質定位均采用相對保留時間定位，請關注相對保留時間的耐用性，必要時考慮采用雜質對照品定位。

解讀：基于便利性及成本考慮，有關物質檢測中雜質定位通常采用相對保留時間（RRT）法，流動相比例、柱溫、洗脫梯度等色譜條件的微小變化均可能影響雜質的RRT，且不同品牌型號的色譜柱對RRT的影響可能尤為顯著，對于相鄰且限度差異大的雜質，定位錯誤可能會影響對產品質量合格與否的判斷，因此有必要對RRT的耐用性進行系統考察。

因此，建議在分析方法耐用性考察時，采用加標供試品溶液或富含雜質的樣品同步對RRT的耐用性進行評估。值得注意的是，雜質RRT可能會受基質效應、高濃度主成分、輔料等因素的影響，供試品溶液與雜質對照品溶液在HPLC中雜質的保留時間可能會有所差異，因此需用供試品加標進行考察。當RRT易受某因素影響時，應嚴格控制影響較大的色譜條件，必要時在質量標準中明確。同時，應將典型色譜圖作為質量標準的附件，以提高定位的準確性。

對于相對于主峰保留時間較難識別的雜質，尤其是相對于主峰保留時間接近的雜質，可考慮采用相對于雜質的保留時間進行定位，例如EP11鹽酸帕羅西汀有關物質檢測，采用雜質對照品定位雜質C，采用相對于雜質C的保留時間定位雜質F（RRT=0.97）和雜質J（RRT=1.02）。

06 穩定性期間變化趨勢異常 

發補意見：穩定性試驗數據顯示，本品雜質H含量隨放置時間延長呈降低趨勢，請對此反?，F象進行分析和研究。

解讀：

穩定性考察期間雜質變化趨勢異常主要包括數據上下波動、隨時間呈下降趨勢、個別時間點異常偏高或偏低等。出現趨勢異常的可能原因是檢測問題、雜質二次降解等。

檢測問題多數是溶液穩定性差造成的。對于主成分在溶液狀態下易降解產生雜質或雜質本身在溶液狀態易降解的產品，應嚴格控制配制后的進樣時間，為保證穩定性期間數據具有可比性，推薦各時間點從樣品配制至進樣的時間盡量保持一致，同時應在質量標準中增加“臨用現制”等操作要求。例如，產品M供試品溶液配制后0h、2h和4h雜質A的含量分別為0.15%、0.19%、0.24%，按照《藥品GMP指南：質量控制實驗室與物料系統》，供試品溶液在2h內溶液穩定（絕對變化量<0.05%），但0h和2h雜質A含量存在一定差異，若每批供試品從樣品配制至進樣的時間不同，則可能會造成穩定性期間變化趨勢異常。

部分產品中的雜質在一定條件下會發生二次降解，因此在穩定性期間呈現下降趨勢，此時應在申報資料中予以解釋說明，基于文獻資料、結構特點等闡明降解機理，必要時可采用雜質對照品穩定性試驗進一步確證。例如，資料顯示磷酸奧司他韋干混懸劑中雜質Ro 68-7010是奧司他韋與輔料中還原性糖反應得到一級降解產物，Ro 69-4458則是Ro 68-7010的二次降解產物。因此，在較低的溫度下產品中雜質Ro 68-7010可能呈先增長后而后趨于穩定或下降的趨勢，在較高溫度下產品中雜質Ro 68-7010則呈現明顯下降趨勢。

07 輔料扣除方法不合理 

發補意見：研究圖譜顯示輔料峰且可能干擾雜質的檢出，請制定合理的輔料峰扣除方法，提供支持性研究資料。

解讀：

有關物質檢測如有輔料出峰，首選采用RRT法扣除，同時推薦在典型色譜圖中注明輔料出峰情況，以更好地識別輔料峰；如采用單一RRT無法準確扣除，或某一段RRT內同時存在多個輔料峰且該位置無雜質峰時，可采用RRT范圍進行扣除，例如ChP 2020雷貝拉唑鈉腸溶片有關物質檢查項下規定“除相對保留時間約為0.44之前的輔料峰外”，復方地芬諾酯片規定“扣除相對保留時間約2.0之后的輔料峰”。對于采用RRT扣除輔料峰，同樣需要對輔料峰的RRT進行耐用性考察。

如輔料峰較難定位或與雜質相鄰，或不同供應商的輔料（常見于香精、表面活性劑、高分子輔料等）出峰情況不同時，可選用輔料定位溶液進行扣除，根據情況可配制全輔料或個別輔料定位溶液，例如ChP 2020鹽酸雷尼替丁泡騰顆粒有關物質檢查項輔料定位溶液為阿司帕坦溶液，其余輔料則采用RRT扣除，質量標準規定“除相對保留時間0.15之前的輔料峰與阿司帕坦峰”。需要關注的是，受基質效應、高濃度主成分等因素影響，輔料定位溶液的保留時間可能與供試品溶液存在差異，此時可考慮采用在供試品溶液中進行輔料加標的方式配制定位溶液。

參考文獻：

[1]《中國藥典》2020年版9102《藥品雜質分析指導原則》

[2]《國家藥品標準工作手冊》

[3]《化學藥品3類注冊申請藥學自評估報告（制劑）（征求意見稿）》

[4]Baertschi S, Alsante K M, Reed R. Pharmaceutical Stress Testing: Predicting Drug Degradation, Second Edition. 2016.

[5]CDE電子刊物：HPLC法校正因子研究中的幾個問題

[6]趙娜，石靖. 仿制藥一致性評價中雜質研究的常見問題探討. 中國醫藥工業雜志. 2021, 52(05): 703-708.

[7]《藥品GMP指南：質量控制實驗室與物料系統》