摘 要： 利用高效液相色譜法測定化橘紅（柚）中的柚皮苷和野漆樹苷，建立指紋圖譜，并進行質量評價。以SHIMADZU Shim-pack GIST C18柱（150 mm×4.6 mm，5 μm）為分離柱，以甲醇-0.3%乙酸溶液（體積比為35∶65）為流動相，等度洗脫，流量為1.0 mL/min，柚皮苷檢測波長為283 nm，野漆樹苷檢測波長為338 nm，采用高效液相色譜法對82批化橘紅進行含量測定。選擇30批化橘紅（柚）飲片，其中沙田柚、蜜柚各15批，建立指紋圖譜，評估相似度并進行聚類分析。柚皮苷和野漆樹苷的質量濃度分別在236.35～630.26、6.01～16.01 µg/mL范圍內與色譜峰面積線性關系良好，相關系數分別為0.999 3、0.996，檢出限分別為0.48、0.31 μg/g。82批樣品中柚皮苷、野漆樹苷的質量分數分別為3.68%～25.40%，0.05%～0.65%，柚的品種不同其含量存在明顯差異，蜜柚含量顯著高于沙田柚。指紋圖譜共標定6個共有色譜峰，指認出2種成分。蜜柚、沙田柚標準圖譜與相對應基源的各批次蜜柚、沙田柚相似度均高于0.95，與不同基源的相似度均小于0.95，所有樣品可聚為2類。建立的方法簡便、快捷、可操作性強，適用于化橘紅（柚）的質量評價及基原區分。

 

關鍵詞： 化橘紅； 柚皮苷； 野漆樹苷； 沙田柚； 蜜柚； 指紋圖譜

 

化橘紅為蕓香科植物化州柚Citrus grandis ‘Tomentosa’或柚Citrus grandis (L.)Osbeck的未成熟或近成熟的干燥外層果皮，前者習稱毛橘紅，后者習稱光橘紅[1]。2024年8月26日，國家衛生健康委和國家市場監督管理總局聯合發布公告，將化橘紅納入按照傳統既是食品又是中藥材的物質目錄，使化橘紅的市場需求進一步擴大。筆者日常工作中發現及文獻報道均顯示目前市場上大范圍流通的，用于入藥、制藥的化橘紅，以柚為基原者居多[2]。柚作為化橘紅的基原之一，在廣東、廣西、福建、湖南均有種植，其中以廣東梅州種植規模及產量最大，而且以沙田柚和蜜柚兩個品種為主[2]。在種植過程中，選果期的幼果經炮制可制成化橘紅[4]。目前化橘紅的質量標準收載于《中華人民共和國藥典》 2020年版一部，含量方面僅對柚皮苷進行規定[5]，多項研究證實野漆樹苷對化橘紅的質量也有重要影響，且關于化橘紅的研究多集中于化州柚[6?7]，而作為市場主要流通品種的化橘紅(柚)的研究較少，不利于化橘紅(柚)的產業發展及質量控制。鑒于此，筆者收集柚產能最大的梅州地區的沙田柚和蜜柚鮮果，制成化橘紅(柚)飲片，以柚皮苷和野漆樹苷含量作為評價指標，分析不同品種和規格化橘紅的質量差異，并針對不同基原化橘紅(柚)建立指紋圖譜，以完善化橘紅(柚)的質量評價方法，為化橘紅(柚)的質量監管及產業開發提供技術支撐。

 

1 實驗部分

1.1 主要儀器與試劑

高效液相色譜儀：Agilent1200型，配二極管陣列檢測器，美國安捷倫科技有限公司。

電子天平：XSR205DV/A型，感量分別為0.1、0.01 mg (可調)，瑞士梅特勒-托利多公司。

超聲波清洗器：KQ500D型，昆山市超聲儀器有限公司。

超純水系統：ULUP-Ⅰ-5/10/20T型，四川優浦達科技有限公司。

柚皮苷對照品：質量分數為93.5%，批號為110722-202116，中國食品藥品檢定研究院。

野漆樹苷對照品：質量分數為95.5%，批號為111919-201804，中國食品藥品檢定研究院。

甲醇、乙腈、乙酸：均為色譜純，天津四友精細化學品有限公司。

磷酸：色譜純，阿拉丁生化科技股份有限公司。

實驗用所有其余試劑均為分析純。實驗用水為超純水。化橘紅藥材/飲片：共收集了在自然栽培中選果期的82批鮮果，基原為蕓香科植物柚Citrus grandis (L.) Osbeck，包括56批沙田柚和26批蜜柚，均產自廣東梅州，其中66批委托飲片公司生產，16批為自制樣品，具體規格、果徑、采摘日期見表1和表2。

表1   56批沙田柚藥材和飲片信息

Tab. 1   Information on 56 batches of Shatian pomelo osbeck herbal material and decoction pieces

 

表2   26批蜜柚藥材和飲片信息

Tab. 2   Information on 26 batches of honey pomelo osbeck herbal material and decoction pieces

 

1.2 色譜條件

(1) 含量測定。色譜柱：SHIMADZU Shim-pack GIST C18柱(150 mm×4.6 mm，5 μm，日本島津公司)；流動相：甲醇-0.3%乙酸溶液(體積比為35∶65)；流量：1.0 mL/min；洗脫方式：等度洗脫；檢測波長：柚皮苷為283 nm，野漆樹苷為338 nm；柱溫：30 ℃；進樣體積：5 μL。(2) 指紋圖譜。色譜柱、流動相、柱溫、進樣體積同含量測定；檢測波長：338 nm。

1.3 溶液制備

樣品溶液：將化橘紅藥材/飲片粉碎，混勻，過2＃篩，取約0.5 g，精密稱定，置于100 mL容量瓶中，精密加入甲醇50 mL，超聲處理30 min (功率為150 W，頻率為40 kHz)，放置至室溫，加入50% (體積分數，下同)的甲醇溶液至標線，搖勻，濾過，取續濾液，即得。

混合對照品溶液：精密稱取柚皮苷對照品、野漆樹苷對照品適量，加入甲醇，配制成混合對照品溶液，其中柚皮苷、野漆樹苷的質量濃度分別為393.92、10.02 μg/mL。

1.4 實驗方法

取樣品溶液、混合對照品溶液，按1.2色譜條件進樣測定，以標準曲線法計算82批化橘紅(柚)中柚皮苷、野漆樹苷質量分數，對比不同基原、不同果徑、不同采摘日期的化橘紅(柚)中柚皮苷、野漆樹苷質量分數，為采摘提供參考。取其中30批樣品溶液，按1.2指紋圖譜色譜條件進樣測定，導入中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(2012 A版)，建立沙田柚標準圖譜、蜜柚標準圖譜，分別計算各批次化橘紅(柚)與沙田柚標準圖譜、蜜柚標準圖譜相似度，并對30批樣品指紋圖譜共有色譜峰面積進行聚類分析。

 

2 結果與討論

2.1 色譜條件優化

在前期預試驗中，參照文獻[8?10]方法分別對不同流動相體系(甲醇-水、甲醇-0.3%乙酸溶液、甲醇-0.3%磷酸溶液、乙腈-水、乙腈-0.3%乙酸溶液、乙腈-0.3%磷酸溶液)、不同洗脫方式進行考察。結果發現，以甲醇-0.3%乙酸溶液(體積比為35∶65)為流動相等度洗脫時，各目標物色譜峰可有效分離且基線平分，響應值較大。選取柚皮苷、野漆樹苷含量作為質量評價指標，主要基于上述指標目前被用于廣東省地方中藥材化橘紅胎質量標準中[11]。考慮到野漆樹苷與柚皮苷紫外最大吸收峰有所差異，參照文獻[11]在含量測定時采用不同的波長進行檢測，柚皮苷的檢測波長為283 nm，野漆樹苷的檢測波長為338 nm。

2.2 樣品處理條件優化

參照文獻[12?15]方法，分別考察了不同提取溶劑(甲醇、體積分數為50%的甲醇溶液、乙醇、體積分數為52.9%的乙醇溶液)和不同超聲提取時間(10、30、50 min)的提取效果。結果顯示，以甲醇為提取溶劑，超聲提取30 min后加入50%的甲醇溶液定容時，目標成分提取效率較高，且可有效去除雜質，保持基線的穩定性，所獲得的樣品色譜圖雜質干擾少，各目標峰面積均較大，故選擇50%甲醇溶液為提取溶劑，超聲提取時間為30 min。

2.3 專屬性試驗

取混合對照品溶液、樣品溶液，按1.2色譜條件進樣測定，色譜圖如圖1所示。由圖1可以看出，樣品溶液色譜圖與柚皮苷對照品、野漆樹苷對照品保留時間相對應，各組分色譜峰分離度均符合要求，理論板數均大于3 000，表明該方法專屬性良好。

圖1   混合對照品溶液、樣品溶液色譜圖

Fig. 1   Chromatograms of mixed reference solution and sample solution

1—柚皮苷； 2—野漆樹苷

2.4 線性方程與檢出限

分別取柚皮苷、野漆樹苷對照品適量，用甲醇制備成不同質量濃度的系列混合對照品溶液，按1.2色譜條件進樣檢測，以各對照品質量濃度為橫坐標(x)，以對應的色譜峰面積為縱坐標(y)，繪制標準工作曲線，計算線性方程和相關系數。柚皮苷線性方程為y=1 871.9x+25.554，相關系數為0.999 3，質量濃度線性范圍為236.35～630.26 µg/mL；野漆樹苷線性方程為y=2 369.7x+10.515，相關系數為0.996，質量濃度線性范圍為6.01～16.01 µg/mL。

將混合對照品溶液逐級稀釋后，按1.2色譜條件進樣檢測，分別以3倍信噪比和10倍信噪比對應的質量濃度為方法檢出限和定量限，根據取樣質量為0.5 g及定容體積為100 mL換算為樣品中的質量分數，計算得柚皮苷的檢出限、定量限分別為0.48、1.61 μg/g，野漆樹苷的檢出限、定量限分別為0.31、1.03 μg/g。

2.5 精密度試驗

精密稱取1＃樣品，按1.3方法平行制備6份樣品溶液，在1.2色譜條件下進樣測定，結果見表3。由表3可知，柚皮苷、野漆樹苷質量分數測定結果的相對標準偏差分別為0.40%、1.35%，表明該方法的精密度良好。

表3   精密度試驗結果

Tab. 3   Precision test results

 

2.6 穩定性試驗

精密稱取1＃樣品，按1.3方法制備樣品溶液，按1.2色譜條件，分別于第0、2、4、6、8、24 h進樣測定，記錄色譜圖，結果見表4。由表4可知，柚皮苷、野漆樹苷色譜峰面積測定結果的相對標準偏差分別為0.27%、0.86%，表明樣品溶液在24 h內穩定。

表4   穩定性試驗結果

Tab.4   Stability test results

 

2.7 樣品加標回收試驗

精密稱取1＃樣品，分別按樣品中待測組分量0.8∶1、1∶1、1.2∶1的質量比加入柚皮苷、野漆樹苷對照品，按1.3方法每個加標水平平行制備2份加標樣品溶液，測定樣品中柚皮苷、野漆樹苷含量，計算加標回收率，結果見表5。由表5可知，柚皮苷、野漆樹苷加標平均回收率分別為97.72%、97.58%，表明該方法的準確度良好。

表5   樣品加標回收試驗結果

Tab.5   Spiked samples recovery test results

 

2.8 樣品含量測定

82批樣品含量測定。按1.3方法制備各批樣品溶液，按1.2色譜條件進樣測定，記錄色譜峰面積，并計算樣品中柚皮苷、野漆樹苷質量分數。結果顯示，82批樣品中柚皮苷、野漆樹苷質量分數分別為3.68%～25.40%、0.05%～0.65%。

(2) 不同果徑蜜柚和沙田柚含量比較。委托廠家生產的66批飲片中，統計蜜柚和沙田柚不同直徑時柚皮苷、野漆樹苷含量的平均值，結果見表6。由表6可以知，不同品種的柚制成的化橘紅飲片，果徑為5～7 cm時柚皮苷含量普遍高于果徑為7～10 cm；相同果徑時，蜜柚中柚皮苷含量明顯高于沙田柚。野漆樹苷的含量隨果徑變化不大，雖然果徑為5～7 cm時野漆樹苷含量平均值稍高，但與果徑為7～10 cm時差異不明顯。沙田柚制成的藥材，以直徑為3～5 cm的小柚果為原材的柚皮苷質量分數為以直徑為5 cm以上的沙田柚為原材的410%，野漆樹苷則為166%。上述結果可看出，不同品種的柚(沙田柚與蜜柚)，兩種目標成分含量存在顯著差異，蜜柚中兩種目標成分的含量普遍高于沙田柚，可能與不同品種柚樹的遺傳背景、生長環境及栽培管理等因素有關。雖然沙田柚制成的化橘紅(柚)中柚皮苷含量較低，但仍高于《中華人民共和國藥典》 2020年版中3.5%的要求，可作為藥用。另外，從果徑來看，果徑小的柚果雖然柚皮苷含量高但產量較小，綜合考慮產量和柚皮苷、野漆樹苷的含量，建議選取果徑為5～7 cm的柚果作為化橘紅(柚)的原料。

表6   不同果徑蜜柚和沙田柚中柚皮苷和野漆樹苷的質量分數

Tab.6   Mass fractions of naringin and rhoifolin in honey pomelos and Shatian pomelos with different fruit diameters

 

(3) 不同采摘日期含量比較。委托廠家生產的66批飲片中，統計蜜柚和沙田柚不同采摘日期時柚皮苷、野漆樹苷含量的平均值，結果見表7。

表7   不同采摘日期柚皮苷和野漆樹苷的質量分數

Tab.7   Mass fraction of naringin and rhoifolin at different harvesting dates

 

由表7可知，2024年5月28日采摘的沙田柚和蜜柚，柚皮苷和野漆樹苷的含量明顯低于前一周(5月21日)，因此，采摘時間建議為5月21日前后，不超過5月底，但具體也要根據天氣情況和地理位置而定，2024年前期梅州地區雨水多，溫度低是否會對柚皮苷、野漆樹苷的含量產生一定影響，有待于后續研究進一步分析。

2.9 指紋圖譜

2.9.1 精密度試驗

精密稱取1＃樣品，按1.3方法平行制備6份樣品溶液，按1.2色譜條件進樣測定，記錄色譜圖。以4號共有色譜峰柚皮苷為參照，計算各共有色譜峰的相對保留時間及相對峰面積，并計算相對標準偏差，結果見表8。由表8可知，各共有色譜峰相對保留時間及相對峰面積的相對標準偏差均小于2%，表明該方法精密度良好。

表8   指紋圖譜精密度及穩定性試驗結果

Tab. 8   Precision and stability test results of fingerprint spectrum

 

2.9.2 穩定性試驗

精密稱取1＃樣品，按1.3方法制備樣品溶液，按1.2色譜條件進樣測定，分別于第0、2、4、6、8、24 h進樣測定，記錄色譜圖。以4號共有色譜峰柚皮苷為參照，計算各共有色譜峰的相對保留時間及相對峰面積，并計算相對標準偏差，結果見表8。由表8可知，各共有色譜峰相對保留時間及相對峰面積的相對標準偏差均小于2%，表明樣品溶液在24 h內穩定。

2.9.3 指紋圖譜建立及特征峰指認

各取30批樣品適量，按1.3方法制備樣品溶液，按1.2色譜條件進樣測定(編號為1～15的沙田柚的指紋圖譜標記為S1～S15；編號為57～71的蜜柚的指紋圖譜標記為M1～M15)，將色譜數據導入中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(2012 A版)，分別以S1、M1圖譜為參照，設定時間窗寬度為0.1 min，采用多點校正和自動匹配[11]，共標定6個共有色譜峰，得到沙田柚、蜜柚樣品HPLC疊加指紋圖譜(如圖2和圖3所示)，以平均數法分別生成沙田柚對照指紋圖譜(如圖4所示)、蜜柚對照指紋圖譜(如圖5所示)，與混合對照品圖譜(如圖6所示)比對，指認出2種成分，其中色譜峰4和色譜峰5對應成分分別為柚皮苷、野漆樹苷。

圖2   沙田柚樣品疊加指紋圖譜

Fig. 2   Overlay fingerprint spectrum of Shatian pomelo samples

1～6—共有色譜峰

圖3   蜜柚樣品疊加指紋圖譜

Fig. 3   Overlay fingerprint spectrum of honey pomelo samples

1～6—共有色譜峰

圖4   沙田柚對照指紋圖譜

Fig. 4   Reference fingerprint chromatograms of Shatian pomelo

1、2、3、6—未確認色譜峰； 4—柚皮苷； 5—野漆樹苷

圖5   蜜柚對照指紋圖譜

Fig. 5   Reference fingerprint chromatograms of honey pomelo

1、2、3、6—未確認色譜峰； 4—柚皮苷； 5—野漆樹苷

圖6   混合對照品指紋圖譜

Fig. 6   Mixed reference standards fingerprint chromatogram

2.9.4 相似度評價

采用中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(2012 A版)軟件，分別以蜜柚標準圖譜及沙田柚標準圖譜為對照，計算各批次樣品相似度，結果見表9。

表9   30批不同基源化橘紅(柚)相似度評價

Tab.9   Similarity evaluation of 30 batches of different basal sources of Citri Grandis (pomelo)

 

由表9可知，建立的蜜柚、沙田柚標準圖譜與相對應基源的各批次蜜柚、沙田柚相似度均高于0.95，與不同基源的相似度均小于0.95，可見建立的指紋圖譜可用于區分蜜柚與沙田柚基源化橘紅(柚)。

2.9.5 聚類分析

將30批化橘紅(柚)中6個共有色譜峰峰面積導入SPSS22.0軟件，進行系統聚類分析，采用組件連接，平方歐氏距離進行分析，結果如圖7所示。

圖7   30批化橘紅（柚）樣品聚類分析

Fig. 7   Cluster analysis of 30 batches of Citri Grandis （pomelo）由圖7可以看出，當分類距離為15時，30批樣品可分為2大類，與樣品來源信息一致，可見指紋圖譜可有效區分不同來源化橘紅(柚)。指紋圖譜作為中藥材質量控制的有效手段，能夠全面反映藥材的化學特征，是鑒別藥材真偽、評價藥材質量的重要依據。該研究成功標定了6個共有色譜峰，并指認出其中2種成分為柚皮苷和野漆樹苷，通過計算相似度，發現蜜柚標準圖譜、沙田柚標準圖譜與各自基原的各批次樣品相似度均高于0.95，而與不同基原的樣品相似度均低于0.95，聚類分析結果也證實指紋圖譜可將2種基原的品種有效區分。不同基原化橘紅(柚)雖然整體化學成分相似，但不同基原化橘紅(柚)各成分含量有一定差異，可通過建立指紋圖譜予以區分。該方法不僅驗證了指紋圖譜的可靠性，也為后續藥材鑒別和質量評價提供了科學依據。

 

3 結論

建立了化橘紅(柚)中柚皮苷和野漆樹苷的HPLC測定方法及指紋圖譜，通過選擇不同產地、不同基原、不同直徑、不同采摘時間的化橘紅(柚)進行試驗，發現不同基原、不同直徑的化橘紅(柚)柚皮苷、野漆樹苷含量存在一定差異，基原為蜜柚時柚皮苷、野漆樹苷含量高于沙田柚，果徑較小的柚皮苷與野漆樹苷含量較高，綜合產量與質量建議采摘5～7 cm者為宜。(2) 指紋圖譜分析結果顯示不同基原化橘紅(柚)雖然整體化學成分相似，但不同基原化橘紅(柚)各成分含量有一定差異，建立的指紋圖譜可有效區分基原為蜜柚和沙田柚的化橘紅(柚)。(3) 該方法操作簡便、專屬性強、準確度高，為化橘紅(柚)的基原鑒別和質量評價提供了新的思路。

 

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