單克隆抗體( monoclonal antibody，簡(jiǎn)稱單抗) 藥物近年來(lái)得到快速發(fā)展，但研發(fā)周期長(zhǎng)和成本高使其患者可及性有待提高。單抗生物類似藥與原研參照藥具有相似的安全性及有效性，生物類似藥的開(kāi)發(fā)是通過(guò)逐步遞進(jìn)的方式進(jìn)行的，包括質(zhì)量相似性、非臨床相似性及臨床相似性研究。這種遞進(jìn)式研究會(huì)降低臨床研究的不確定性，提高藥物開(kāi)發(fā)成功率和患者可及性。因此，單抗生物類似藥被很多生物科技公司視為重點(diǎn)研發(fā)方向。對(duì)原研藥的質(zhì)量屬性分析和候選藥質(zhì)量相似性研究是生物類似藥開(kāi)發(fā)的基礎(chǔ)，也為臨床研究設(shè)計(jì)提供了重要依據(jù)。

 

本文結(jié)合國(guó)內(nèi)外生物類似藥的法規(guī)要求、生物類似藥的開(kāi)發(fā)和國(guó)內(nèi)外申報(bào)經(jīng)驗(yàn)，全面闡述了單抗生物類似藥的質(zhì)量相似性研究?jī)?nèi)容，特別是對(duì)于關(guān)鍵質(zhì)量屬性的評(píng)價(jià)難點(diǎn)進(jìn)行了總結(jié)，對(duì)于工藝開(kāi)發(fā)具有重要的參考作用，從而幫助企業(yè)加速藥物的開(kāi)發(fā)進(jìn)度，也給監(jiān)管機(jī)構(gòu)提供技術(shù)支撐。

 

單克隆抗體(簡(jiǎn)稱單抗) 藥物始于20世紀(jì)80 年代，經(jīng)歷了30 多年的發(fā)展，目前已成為生物藥的最大類別。在2019 年全球最暢銷的藥物前十榜單中，僅單抗藥物就占據(jù)6 個(gè)。為了使更多的人能夠獲得優(yōu)質(zhì)的單抗藥物治療，科學(xué)家及制藥企業(yè)通過(guò)一系列的途徑降低成本。其中，生物類似藥的研發(fā)和上市將極大地降低患者使用負(fù)擔(dān)，提高單抗藥物可及性。

 

截至2020 年12 月，歐洲EMA 已批準(zhǔn)69 個(gè)生物類似藥，其中單抗類藥物30 個(gè); 美國(guó)FDA 已批準(zhǔn)28 個(gè)生物類似藥，其中單抗類藥物19 個(gè)。中國(guó)的生物類似藥起步較晚，但發(fā)展迅猛，自2019 年2 月，復(fù)宏漢霖公司研發(fā)的中國(guó)第一個(gè)生物類似藥“漢利康®”上市后，國(guó)家藥品監(jiān)督管理局( NMPA) 已陸續(xù)批準(zhǔn)6 個(gè)生物類似藥上市，均為單抗生物類似藥。在2020 年7 月29 日首個(gè)中國(guó)原研的單抗生物類似藥曲妥珠單抗( Zercepac®) 獲得歐洲EMA 的上市批準(zhǔn)。

 

在進(jìn)行單抗生物類似藥研發(fā)及申報(bào)時(shí)，往往會(huì)遇到很多難題，如比對(duì)參照藥的選擇( 參照藥批次?數(shù)量?效期等) ?分析方法的應(yīng)用?相似性評(píng)價(jià)原則?產(chǎn)品質(zhì)量屬性的評(píng)估等。本文將針對(duì)這些問(wèn)題進(jìn)行討論，以期為單抗生物類似藥的研發(fā)提供思路。

 

1、質(zhì)量相似性研究

 

由于單抗藥物生產(chǎn)工藝和分子結(jié)構(gòu)的復(fù)雜性，實(shí)際上不可能獲得與參照藥完全一致的產(chǎn)品。如何評(píng)估生物類似藥與參照藥在質(zhì)量?安全?有效性上的相似性是生物類似藥研發(fā)過(guò)程中必須解決的問(wèn)題。我國(guó)在生物類似藥的研發(fā)數(shù)量上位居全球第一，筆者根據(jù)單抗生物類似藥的研發(fā)實(shí)踐經(jīng)驗(yàn)，對(duì)質(zhì)量相似性研究的解析，總結(jié)為如下4 個(gè)方面。

 

1. 1 基本原則

 

根據(jù)《生物類似藥研發(fā)與評(píng)價(jià)技術(shù)指導(dǎo)原則》，生物類似藥研發(fā)和評(píng)價(jià)的基本原則為: 比對(duì)原則?逐步遞進(jìn)原則?一致性原則和相似性評(píng)價(jià)原則。在2021 年發(fā)布的《生物類似藥相似性評(píng)價(jià)和適應(yīng)癥外推技術(shù)指導(dǎo)原則》中，則和歐美的指導(dǎo)原則一致，包括整體相似性和逐步遞進(jìn)的原則。

 

整體相似性側(cè)重于完整的證據(jù)鏈，包含對(duì)藥學(xué)?非臨床?臨床比對(duì)研究的結(jié)果進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)。逐步遞進(jìn)原則是指前期研究中，若候選藥與參照藥間存在差異，需評(píng)估該差異是否對(duì)安全性?有效性產(chǎn)生影響，若不確定其影響，則在后續(xù)的比對(duì)研究中應(yīng)設(shè)計(jì)針對(duì)性的實(shí)驗(yàn)進(jìn)行評(píng)估。

 

1. 2 原研參照藥的考量

 

生物類似藥質(zhì)量屬性的相似性評(píng)價(jià)接受標(biāo)準(zhǔn)，是基于原研參照藥的質(zhì)量分析結(jié)果而確定的。關(guān)于原研參照藥的選擇有以下幾個(gè)方面需要考慮。

 

1. 2. 1 批次要求

 

歐洲EMA 和美國(guó)FDA 的相似性指導(dǎo)原則中對(duì)參照藥的要求基本一致。以美國(guó)最新的指導(dǎo)原則為例，應(yīng)進(jìn)行包含至少10 批參照藥的質(zhì)量相似性比對(duì)研究，且涵蓋原研藥的效期范圍。若因特殊原因而不足10批，需及時(shí)與美國(guó)FDA 溝通進(jìn)行評(píng)估。對(duì)于候選生物類似藥，需要包含6-10個(gè)代表商業(yè)化生產(chǎn)工藝批次樣品，通常包括關(guān)鍵臨床使用和工藝驗(yàn)證批次。用于相似性研究的候選藥如果批次間發(fā)生了工藝變更，則需要提供工藝可比性研究，保證不同工藝產(chǎn)品在質(zhì)量?安全性?有效性上的一致。

 

1. 2. 2 來(lái)源地考慮

 

在早期研發(fā)階段，通常會(huì)盡可能地收集多個(gè)來(lái)源地的原研藥為參考，進(jìn)行候選藥的工藝開(kāi)發(fā)及質(zhì)量研究。在生物類似藥上市申請(qǐng)時(shí)，中國(guó)NMPA?歐洲EMA和美國(guó)FDA均要求參與質(zhì)量相似性研究的參照藥應(yīng)為申報(bào)地同等來(lái)源。若選擇了非申報(bào)地來(lái)源的參照藥參與相似性評(píng)估，則需要提供候選生物類似藥和不同來(lái)源參照藥兩兩間的相似性研究數(shù)據(jù)作為支持。

 

美國(guó)FDA 在最新的指導(dǎo)原則中明確提出，用在比對(duì)研究( 包括理化分析?功能研究?動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和臨床研究) 中的所有參照藥和生物類似藥的數(shù)據(jù)和信息都應(yīng)體現(xiàn)在生物藥上市申請(qǐng)( biologics license application, BLA) 資料包中。如果相似性研究中排除了某個(gè)批次的樣品，需要提供相應(yīng)的評(píng)估依據(jù)。

 

1. 2. 3 參照藥管理

 

參照藥的選擇，除了批次數(shù)量和來(lái)源外，還需要關(guān)注其保存條件及管理流程。根據(jù)筆者經(jīng)驗(yàn)，目前國(guó)內(nèi)采購(gòu)參照藥周期較長(zhǎng)，在進(jìn)行頭對(duì)頭分析比對(duì)實(shí)驗(yàn)時(shí)，參照藥可能會(huì)超過(guò)效期。為了解決此問(wèn)題，可采用在效期前將樣品凍存，但要有相應(yīng)的方案和實(shí)驗(yàn)證明凍存步驟對(duì)樣品的質(zhì)量屬性沒(méi)有影響，這也是國(guó)內(nèi)外監(jiān)管機(jī)構(gòu)所能接受的。(這里的意思是在效期之前把樣品凍存起來(lái)可以當(dāng)做不過(guò)期樣品來(lái)用？)在上市申請(qǐng)的現(xiàn)場(chǎng)核查中，審評(píng)員也會(huì)關(guān)注參照藥的管理，即采購(gòu)?分裝?保存和領(lǐng)用等記錄，以保障質(zhì)量相似性研究過(guò)程中參照藥數(shù)據(jù)的真實(shí)性和可追溯性。

 

1. 3 分析方法

 

質(zhì)量相似性研究是生物類似藥注冊(cè)申報(bào)的主要內(nèi)容，對(duì)于應(yīng)用的分析方法適用性及穩(wěn)定性要求很高: ① 需要是當(dāng)前行業(yè)和技術(shù)領(lǐng)域最先進(jìn)的，即“state-of-the-art”分析方法，要有足夠的靈敏度，能觀察到生物類似藥和原研參照藥關(guān)鍵質(zhì)量屬性之間的細(xì)微差別，特別是穩(wěn)定性比對(duì)中的降解產(chǎn)物的識(shí)別，即“stability indicating”能力。② 對(duì)于同一質(zhì)量屬性，要選擇正交的分析方法和技術(shù)進(jìn)行研究，如采用基于不同的原理( 物理?化學(xué)或生物學(xué)) 的分析方法。③ 除了正常的原液( drug substance, DS) /成品( drug product, DP) 放行檢測(cè)外，質(zhì)量相似性研究還應(yīng)包括更全面的結(jié)構(gòu)和特性鑒定研究。此類分析方法，根據(jù)其本身特性，雖不需要如放行檢測(cè)方法的驗(yàn)證要求，但也要從科學(xué)角度證明其合理性?可靠性和可重復(fù)性。根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道?監(jiān)管部門審評(píng)要求和實(shí)踐經(jīng)驗(yàn)，一般用于質(zhì)量相似性的分析方法匯總見(jiàn)表1。

 

 

 

 

1. 4 質(zhì)量屬性的相似性可接受標(biāo)準(zhǔn)

 

美國(guó)FDA 在2017 年推出了一個(gè)指導(dǎo)原則草案( 目前已撤銷) ，該草案對(duì)質(zhì)量相似性評(píng)估的屬性分級(jí)( Tier) 和相應(yīng)評(píng)估策略進(jìn)行了描述，包括統(tǒng)計(jì)分析方法確定相似性評(píng)估的范圍。2019年，美國(guó)FDA 發(fā)布了最新的生物類似藥質(zhì)量相似性評(píng)估的指導(dǎo)原則，強(qiáng)調(diào)了質(zhì)量范圍法確定相似性評(píng)估的范圍，評(píng)估方式更加靈活。歐洲EMA在2017年發(fā)布的指導(dǎo)原則中，介紹了統(tǒng)計(jì)學(xué)評(píng)估方法，包括Min-Max法?Tolerance Intervals 法和質(zhì)量范圍法( X-sigma) ，與美國(guó)FDA 的法規(guī)中描述一致。對(duì)質(zhì)量屬性的分級(jí)需要建立在對(duì)產(chǎn)品質(zhì)量全面認(rèn)知的基礎(chǔ)上，且需要遵循“case-by-case”的理念，表1 中的案例可供參考。需要注意的是，盡管推斷統(tǒng)計(jì)方法( inferential statistical methods) ，如等效性分析，在臨床研究中被廣泛應(yīng)用，但在質(zhì)量屬性評(píng)估中，受到樣本數(shù)量和樣本選擇的影響，可能會(huì)得到假陽(yáng)性的結(jié)論。

 

在根據(jù)參照藥質(zhì)量分析數(shù)據(jù)設(shè)定相似性評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)時(shí)，要考慮到因參照藥本身工藝變化，導(dǎo)致一些質(zhì)量屬性出現(xiàn)變化的因素。法規(guī)部門針對(duì)這個(gè)現(xiàn)象并沒(méi)有明確的建議，企業(yè)的研究人員要積累不同階段參照藥的質(zhì)量數(shù)據(jù)變化趨勢(shì)，并評(píng)估這種變化對(duì)產(chǎn)品安全性?有效性的影響，以及相似性評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)的合理設(shè)定。在“漢曲優(yōu)”的質(zhì)量相似性研究中，觀測(cè)到有效期在2017 年3月-2021年3月的參照藥呈現(xiàn)了糖型比例( 尤其是半乳糖化和去巖藻糖化) 變化，對(duì)應(yīng)的抗體依賴細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒作用( antibody dependent cell-mediated cytotoxicity, ADCC) 和FcγRIIIa結(jié)合活性都呈現(xiàn)了一致的變化，經(jīng)過(guò)評(píng)估，表明該變化和參照藥工藝變更相關(guān)，對(duì)產(chǎn)品的安全性及有效性無(wú)影響。

 

2、質(zhì)量相似性研究中關(guān)鍵點(diǎn)的考量

 

質(zhì)量相似性是生物類似藥研發(fā)的基礎(chǔ)，需要對(duì)原研藥的質(zhì)量屬性進(jìn)行剖析，并以此為參照開(kāi)發(fā)相似藥的工藝。單抗藥物質(zhì)量相似性研究重點(diǎn)關(guān)注的質(zhì)量屬性，包括一級(jí)結(jié)構(gòu)?高級(jí)結(jié)構(gòu)?糖基化?蛋白質(zhì)含量?電荷異質(zhì)性?分子大小變異體?顆粒分析?雜質(zhì)分析?生物學(xué)活性及免疫學(xué)特性等。

 

2. 1 一級(jí)結(jié)構(gòu)

 

一級(jí)結(jié)構(gòu)通常指其氨基酸序列，是高級(jí)結(jié)構(gòu)及生物學(xué)功能的基礎(chǔ)。生物類似藥原則上要求氨基酸序列和參照藥保持一致。一級(jí)結(jié)構(gòu)相關(guān)的質(zhì)量屬性分析通常包含氨基酸序列?蛋白分子量?翻譯后修飾?二硫鍵和游離巰基等內(nèi)容。

 

2. 1. 1 氨基酸序列及分子量

 

一級(jí)結(jié)構(gòu)的表征方法多是基于液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)( LC-MS) ，從分子的不同水平進(jìn)行分析，再輔以其他方法進(jìn)行正交分析。從完整分子?亞基水平和肽段水平3個(gè)維度，可以全面地比對(duì)分析生物類似藥和參照藥的氨基酸序列的一致性。一些方法，如氨基酸定量法和Edman降解法等，可以作為正交分析方法證明氨基酸序列的一致性。除了氨基酸序列之外，生物類似藥和參照藥的鏈間和鏈內(nèi)二硫鍵的連接方式是否和理論一致也十分重要，一般通過(guò)二硫鍵鑒定和游離巰基定量檢測(cè)2個(gè)方法進(jìn)行評(píng)估。

 

2. 1. 2 二硫鍵

 

二硫鍵分析一般通過(guò)非還原肽圖進(jìn)行鑒定。樣品經(jīng)過(guò)Lyc-C和Trypsin順序酶切，得到帶有二硫鍵的肽段，進(jìn)行肽段分子量和二級(jí)質(zhì)譜分析，并與理論序列進(jìn)行比對(duì)，以確證生物類似藥和參照藥的二硫鍵連接方式一致性。游離巰基的定量則通過(guò)Ellman試劑或其他熒光染料與巰基的反應(yīng)進(jìn)行，其檢測(cè)結(jié)果也能側(cè)面反映生物類似藥和參照藥的二硫鍵結(jié)構(gòu)一致性。

 

2. 1. 3 翻譯后修飾

 

翻譯后修飾是單抗異質(zhì)性的原因之一，也是影響其生物學(xué)活性和功能的因素之一，生物類似藥和參照藥翻譯后修飾位點(diǎn)和含量的一致性是質(zhì)量相似性研究的重要一環(huán)。針對(duì)除糖基化之外的翻譯后修飾，按照位點(diǎn)和修飾類型進(jìn)行分類。

 

2. 1. 3. 1 脫酰胺

 

單抗分子的天冬酰胺和谷氨酰胺會(huì)發(fā)生脫酰胺轉(zhuǎn)化為天冬氨酸和谷氨酸，是一種常見(jiàn)的翻譯后修飾。正常人體內(nèi)的免疫球蛋白G1( immunoglobulin G1, IgG1) 和免疫球蛋白G2( immunoglobulin G2, IgG2) 在315 位和384 位天冬酰胺易發(fā)生脫酰胺修飾，有報(bào)道約23%的Asn384 發(fā)生了脫酰胺修飾，而谷氨酰胺的脫酰胺修飾常見(jiàn)于抗體的恒定區(qū)。脫酰胺修飾會(huì)發(fā)生在抗體的多個(gè)位點(diǎn)，不同位點(diǎn)的敏感程度不同，跟單抗高級(jí)結(jié)構(gòu)有一定的聯(lián)系。若抗體分子存在NG基序，則易受到樣品處理的影響而產(chǎn)生高比例的翻譯后修飾。因此，在質(zhì)量相似性研究中，應(yīng)關(guān)注脫酰胺修飾的位點(diǎn)和比例，評(píng)估其對(duì)單抗分子的安全性和有效性的影響。

 

2. 1. 3. 2 氧化

 

抗原互補(bǔ)決定區(qū)( complementarity determining region,CDR) 中甲硫氨酸( methionine,M) 氧化可能會(huì)影響抗原結(jié)合活性; 抗體可結(jié)晶區(qū)域( crystallizable fragment,Fc) 的氧化修飾可能會(huì)影響抗體的熱穩(wěn)定性?蛋白A( protein A) 結(jié)合能力和新生兒受體( neonatal Fc receptor,FcRn) 結(jié)合活性。因此，在評(píng)估氧化修飾時(shí)，應(yīng)同時(shí)關(guān)注其氧化修飾的位點(diǎn)和水平。

 

例如，F(xiàn)c 段的M252和M428是較易發(fā)生氧化修飾的2 個(gè)位點(diǎn)，構(gòu)象上比較接近，均位于CH2 /CH3 的交界表面，臨近FcRn 結(jié)合區(qū)域和Protein A 結(jié)合區(qū)域。研究表明，約40% 的M252氧化修飾會(huì)顯著降低單抗血清半衰期。然而，單抗分子普遍存在低比例的M252和M428氧化修飾，如赫賽汀和其生物類似藥分別發(fā)現(xiàn)有約4%和10%的氧化修飾。

 

2. 1. 3. 3 N-端修飾

 

單抗分子的N-端多發(fā)生谷氨酰胺或谷氨酸的環(huán)化反應(yīng)而形成焦谷氨酸，是生物體內(nèi)比較常見(jiàn)的修飾，一般認(rèn)為其不影響生物學(xué)活性和功能，但該修飾和單抗的電荷異質(zhì)性相關(guān)，相似性研究中可結(jié)合電荷異質(zhì)性分析結(jié)果綜合評(píng)估。

 

2. 1. 3. 4 C-端修飾

 

血清中的抗體重鏈C-端通常為甘氨酸，而IgG 的編碼基因顯示C-端為賴氨酸。研究表明，在體內(nèi)存在一種內(nèi)源羧肽酶B，可以將抗體的C-端賴氨酸切除。因此，在質(zhì)量相似性研究中，通常認(rèn)為C-末端賴氨酸的切除不影響產(chǎn)品的安全性和有效性。在單抗生產(chǎn)過(guò)程中，C-端賴氨酸未完全切除會(huì)導(dǎo)致單抗的電荷異質(zhì)性發(fā)生變化。因此，在電荷異質(zhì)性的相似性評(píng)估中要考慮這種修飾帶來(lái)的影響。

 

一些其他修飾如異構(gòu)化?胱氨酸化?糖化等，應(yīng)結(jié)合其含量?位點(diǎn)和相關(guān)活性及功能研究進(jìn)行相似性評(píng)估。

 

2. 2 高級(jí)結(jié)構(gòu)

 

高級(jí)結(jié)構(gòu)對(duì)單抗藥物的生物學(xué)功能發(fā)揮十分重要，采用正交技術(shù)從各個(gè)方面對(duì)其進(jìn)行相似性評(píng)估，包括抗體二級(jí)結(jié)構(gòu)及三級(jí)結(jié)構(gòu)分析。

 

二級(jí)結(jié)構(gòu)分析一般采用遠(yuǎn)紫外圓二色譜和紅外光譜2種技術(shù)，三級(jí)結(jié)構(gòu)通過(guò)近紫外圓二色譜的方法進(jìn)行分析; 差示掃描量熱分析通過(guò)蛋白質(zhì)的熱穩(wěn)定性變化反映結(jié)構(gòu)的變化; 熒光光譜則反映蛋白質(zhì)中特定氨基酸( 色氨酸等) 在空間的位置和環(huán)境; 蛋白質(zhì)的核磁圖譜取決于其所有的高級(jí)結(jié)構(gòu)形式，包括氨基酸類型?二級(jí)結(jié)構(gòu)和三級(jí)結(jié)構(gòu)引起的化學(xué)位移，以及氫氘交換的動(dòng)力學(xué)差異; 超速離心方法通過(guò)對(duì)比蛋白質(zhì)單體?碎片及聚體在自然狀態(tài)下的沉降速率，從而反映蛋白質(zhì)在溶液狀態(tài)下的高級(jí)結(jié)構(gòu)差異。

 

由于高級(jí)結(jié)構(gòu)的分析方法多為定性方法，其比對(duì)方式多為圖譜相似; 或者采用一些經(jīng)驗(yàn)?zāi)Ｐ蛯?duì)圖譜進(jìn)行進(jìn)一步解析，獲得一些參數(shù)進(jìn)行相似度比較。經(jīng)驗(yàn)?zāi)Ｐ投鄟?lái)源于文獻(xiàn)或者自建，因此需要在分析結(jié)果處備注計(jì)算的軟件或模型出處。例如，采用Thermo OMINC 計(jì)算圖譜相似度，數(shù)值越接近于1，說(shuō)明圖譜越相似。但此方法需要一定的實(shí)驗(yàn)次數(shù)，且對(duì)微小信號(hào)的差異不敏感，仍需結(jié)合圖譜目視比較進(jìn)行分析。Amgen 公司的科學(xué)家提出一種WSD( weighed spectra difference) 的計(jì)算公式，通過(guò)加權(quán)偏差計(jì)算的方式，更敏感地反映圖譜間差異。對(duì)于高級(jí)結(jié)構(gòu)分析而言，統(tǒng)計(jì)學(xué)分析手段的應(yīng)用將是趨勢(shì)。

 

2. 3 糖基化

 

治療用單克隆抗體制品是一種糖蛋白，單抗的糖基化通常發(fā)生在Fc段，較少情況下發(fā)生在Fab端。在相似性研究中，主要從有效性和安全性兩個(gè)方面對(duì)糖基化進(jìn)行評(píng)價(jià)。糖基化對(duì)有效性的影響表現(xiàn)在不同糖型對(duì)抗體空間結(jié)構(gòu)的影響，從而影響到Fc 段介導(dǎo)的效應(yīng)功能。不同單抗藥物的作用機(jī)制不同，糖型類別的相似性評(píng)價(jià)要求也相應(yīng)不同。如IgG2/IgG4亞型的單抗藥物，因?yàn)镃H2 結(jié)構(gòu)域里對(duì)Fcγ 受體和補(bǔ)體C1q( complement C1q) 結(jié)合能力特異的氨基酸序列缺失，導(dǎo)致其ADCC 和補(bǔ)體依賴細(xì)胞毒作用( complementdependent cytotoxicity,CDC) 較弱，此類抗體一般用來(lái)中和抗原或阻斷受體配體的結(jié)合; 因此，這類抗體的去巖藻糖化糖( Afuc) 和半乳糖苷化糖( Gal)風(fēng)險(xiǎn)級(jí)別不高，相似性評(píng)價(jià)中主要考慮其能反映抗體的結(jié)構(gòu)完整性和工藝一致性屬性。對(duì)于IgG1亞型抗體，ADCC 和CDC 效應(yīng)是其典型的作用機(jī)制，如利妥昔單抗，Gal，Afuc 和高甘露糖( Man) 的相似性評(píng)價(jià)要重點(diǎn)考慮; 但也要遵守case-by-case 的原則，如曲妥珠單抗[4]和貝伐珠單抗，前者因?yàn)槿吮砥どL(zhǎng)因子受體2 ( human epidermal growth factorreceptor 2,HER2) 高表達(dá)抑制補(bǔ)體通路，缺失CDC效應(yīng)，后者因?yàn)榘邢蚩扇苄钥乖琈oA 中ADCC 和CDC 效應(yīng)均缺失，相應(yīng)糖型的微小差異并不影響產(chǎn)品有效性。還有研究表明，含有高比例Man5 修飾的抗體在血清中的半衰期會(huì)降低。

 

糖基化對(duì)安全性的影響主要是免疫原性，表現(xiàn)為末端唾液酸和α-1,3連接半乳糖。唾液酸有N-羥乙酰神經(jīng)氨酸( N-glycolylneuraminic acid,NGNA) 和N-乙酰神經(jīng)氨酸( N-acetylneuraminic acid,NANA) 2 種形式，NANA 類型的唾液酸在正常人血清抗體中普遍存在，而人體內(nèi)存在抗NGNA 抗體，Reusch等研究報(bào)道了抗NGNA 抗體引發(fā)的免疫反應(yīng)。在部分由鼠源細(xì)胞表達(dá)生產(chǎn)的抗體中，存在NGNA和α-1,3連接半乳糖的修飾，但對(duì)于大多數(shù)由中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞表達(dá)的單抗產(chǎn)品，NGNA 和α-1,3 連接半乳糖的含量通常低于檢測(cè)方法的檢測(cè)限，在這種情況下相似性研究的評(píng)級(jí)可考慮為中等級(jí)別。

 

2. 4 含量

 

含量是相似性評(píng)價(jià)的重要內(nèi)容，生物類似藥的制劑處方和規(guī)格原則上要和參照藥一致，因此需要評(píng)價(jià)蛋白濃度的相似性，歐洲EMA 的生物類似藥指導(dǎo)原則明確指出了“strength”要相似。對(duì)于液體或凍干制劑，蛋白濃度的測(cè)定通常采用紫外分光光度法，在頭對(duì)頭的比對(duì)分析中，消光系數(shù)也是非常重要的一環(huán)。

 

蛋白質(zhì)的消光系數(shù)通常由氨基酸序列決定。在研發(fā)早期通常采用理論消光系數(shù)的數(shù)值進(jìn)行濃度測(cè)定，在工藝開(kāi)發(fā)進(jìn)入一定的階段后( 工藝參數(shù)鎖定)，通常需要對(duì)消光系數(shù)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)確認(rèn)。推薦采用氨基酸含量測(cè)定?凱氏定氮法?Edelhoch 法等多種方法，對(duì)蛋白質(zhì)的消光系數(shù)進(jìn)行測(cè)定和評(píng)估，并建立可接受標(biāo)準(zhǔn)，最終確定消光系數(shù)。對(duì)于生物類似藥而言，不能僅僅根據(jù)市售產(chǎn)品的標(biāo)識(shí)濃度反推獲得，而是要采用實(shí)驗(yàn)方法確定。

 

2. 5 電荷異質(zhì)性

 

抗體在生產(chǎn)?儲(chǔ)存和運(yùn)輸過(guò)程中，會(huì)產(chǎn)生蛋白分子的翻譯后修飾以及聚體和碎片，導(dǎo)致了具有不同等電點(diǎn)( isoelectric point,pI) 蛋白變異體的產(chǎn)生。相似性評(píng)價(jià)對(duì)電荷異質(zhì)性要求較高，首先要通過(guò)色譜技術(shù)( 適用于IgG1抗體) ，或者自由流電泳技術(shù)( 適用于IgG2和IgG4抗體) 制備和富集抗體中的酸和堿性變異體，鑒定其形成原因，建立結(jié)構(gòu)和功能的關(guān)系( structure-function relationship,SFR)，并評(píng)估各變異體對(duì)安全性和有效性的影響; 其次，需要建立合適的分析方法，對(duì)各酸堿組分的含量進(jìn)行分析?統(tǒng)計(jì)計(jì)算和相似性評(píng)價(jià)。抗體的電荷變異體分析，根據(jù)不同的原理可采用離子交換色譜法( ion exchange chromatography, IEX) 和毛細(xì)管等電聚焦技術(shù)( capillary isoelectric focusing,cIEF)，前者是根據(jù)不同電荷變異體表面電荷的差異在色譜柱上實(shí)現(xiàn)分離，后者是根據(jù)不同變異體的等電點(diǎn)差異進(jìn)行分離分析。電荷異質(zhì)性受蛋白表達(dá)平臺(tái)( 細(xì)胞株和培養(yǎng)工藝) 和純化工藝影響很大，工藝開(kāi)發(fā)中要平衡生產(chǎn)收率和相似性評(píng)價(jià)2 個(gè)因素，例如對(duì)于C 末端賴氨酸剪切程度不同引起的堿性組分，如前文描述，其不會(huì)影響臨床安全性和有效性，相似性評(píng)價(jià)時(shí)樣品可經(jīng)過(guò)CpB 酶切后進(jìn)行測(cè)試和評(píng)估。

 

2. 6 分子大小變異體

 

分子大小變異體為產(chǎn)品相關(guān)雜質(zhì)，主要表現(xiàn)為高分子量物質(zhì)( high molecular weight species,HMWS) 和低分子量物質(zhì)( low molecular weight species,LMWS) ，具有潛在的安全性影響，是需要嚴(yán)格控制的質(zhì)量屬性。HMWS 的鑒定采用多角度激光光散射檢測(cè)器(multi-angle light scattering,MALS) 和超速離心分析(analytical ultracentrifugation，AUC) ，定量分析通常采用2 種正交的分析技術(shù)，即體積排阻色譜(size exclusion chromatography,SEC) 和AUC; LMWS 的評(píng)估采用毛細(xì)管電泳分析技術(shù)(capillary electrophoresis sodium dodecyl sulfate,CE-SDS) 。在相似性評(píng)估中，首先要確認(rèn)候選藥的HMWS和LMWS 的種類和含量要與參照藥相似，否則要加以鑒定和評(píng)估; 其次，純度和雜質(zhì)的定量分析方法要經(jīng)過(guò)驗(yàn)證，特別是雜質(zhì)含量的定量限(limit of quantitation,LOQ) 或檢測(cè)限(limit of detection,LOD) 驗(yàn)證; 最后，相似性評(píng)估的標(biāo)準(zhǔn)是建立在至少10 批次以上參照藥分析數(shù)據(jù)的基礎(chǔ)上計(jì)算得出。對(duì)于雜質(zhì)的范圍，可采用單邊的限定方式，但不應(yīng)該超出放行標(biāo)準(zhǔn)范圍。

 

2. 7 顆粒分析

 

蛋白顆粒是抗體藥物的重要質(zhì)量屬性之一，與產(chǎn)品的安全性息息相關(guān)。顆粒粒徑在100 nm -1μm 被定義為亞微顆粒，1-100μm 通常為亞可見(jiàn)顆粒，大于100 μm為可見(jiàn)顆粒，小于100 nm為可溶性聚體或者蛋白分子。通常，可見(jiàn)顆粒和聚體在生產(chǎn)過(guò)程中被嚴(yán)格監(jiān)控，并控制在極低水平下; 對(duì)于亞可見(jiàn)微粒，有體外實(shí)驗(yàn)表明其可能引起免疫原性，且有堵塞毛細(xì)血管的風(fēng)險(xiǎn)。

 

在質(zhì)量相似性評(píng)估中，顆粒分析通常不進(jìn)行考察，需要在候選藥的放行和穩(wěn)定性中進(jìn)行監(jiān)控和評(píng)估。但一些國(guó)內(nèi)外的生物類似藥的相似性研究中都包含了此項(xiàng)比對(duì)，如Amgen公司利用微流成像法(micro-flow imaging,MFI) 和光阻法(light obscuration,LO) 比對(duì)了貝伐珠單抗和阿達(dá)木單抗類似藥的亞可見(jiàn)顆粒，采用動(dòng)態(tài)光散射(dynamic light scattering,DLS) 和場(chǎng)流分析(field flow fractionation,FFF) 研究比對(duì)了亞微顆粒; 上海復(fù)宏漢霖公司采用DLS 和MFI 分析了曲妥珠單抗及其生物類似物的顆粒表現(xiàn)。

 

2. 8 雜質(zhì)分析

 

根據(jù)ICH Q6B，單抗產(chǎn)品的雜質(zhì)可以分為產(chǎn)品相關(guān)雜質(zhì)(product-related impurities) 和工藝相關(guān)雜質(zhì)(process-related impurities) 2 類。在相似性評(píng)估中，對(duì)產(chǎn)品相關(guān)雜質(zhì)的評(píng)估主要在于其對(duì)安全性?有效性的影響。工藝相關(guān)雜質(zhì)和產(chǎn)品相關(guān)雜質(zhì)一樣，能引起安全性風(fēng)險(xiǎn)，是需要嚴(yán)格控制的，包括如: 細(xì)胞株構(gòu)建和細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程引入的殘留宿主細(xì)胞蛋白?宿主細(xì)胞DNA?抗生素?糖型調(diào)節(jié)劑?保護(hù)劑等，下游工藝引入的殘留Protein A 以及殘留于制劑終產(chǎn)品中的內(nèi)毒素和浸出物等，工藝相關(guān)雜質(zhì)種類和殘留量取決于具體工藝情況。這些雜質(zhì)是不需要和參照藥相似，但要采用先進(jìn)靈敏的分析方法進(jìn)行檢測(cè)和必要控制，使其在安全的限值以內(nèi)。因此，工藝相關(guān)雜質(zhì)不在相似性研究范圍內(nèi)。

 

2. 9 生物學(xué)活性

 

生物學(xué)活性和藥物的MoA 相關(guān)。生物學(xué)活性分析是相似性評(píng)價(jià)的重點(diǎn)，根據(jù)抗體結(jié)構(gòu)分為Fab，F(xiàn)c以及Fab /Fc 共同參與的功能。抗原抗體結(jié)合活性是單抗活性的基礎(chǔ)，屬于Fab 端的功能區(qū)。Fc 段的生物學(xué)功能將在免疫學(xué)特性章節(jié)介紹。Fab /Fc 共同調(diào)節(jié)的生物學(xué)功能包括ADCC，CDC 及抗體介導(dǎo)的細(xì)胞吞噬作用(antibody-dependent cellular phagocytosis，ADCP) 等。

 

生物學(xué)活性的評(píng)估應(yīng)根據(jù)藥物MoA，并遵循case-by-case 的相似性評(píng)價(jià)原則。如IgG1抗體具有較強(qiáng)的Fcγ 受體和C1q 結(jié)合能力，因此具有較強(qiáng)的ADCC和CDC作用; 如利妥昔單抗的相似性評(píng)價(jià)的級(jí)別通常為高或中等; 而曲妥珠單抗ADCC 在相似性評(píng)價(jià)中被評(píng)為了高等級(jí)，但HER2高表達(dá)的細(xì)胞會(huì)抑制補(bǔ)體途徑，CDC為陰性，所以相似性評(píng)價(jià)中被設(shè)為低等級(jí); 阿達(dá)木單抗的MoA為與可溶性腫瘤壞死因子α( tumor necrosis factor α，TNFα) 特異性結(jié)合以阻斷其與細(xì)胞表面TNFα 受體相互作用，因此相似性評(píng)價(jià)中抗體中和活性為高等級(jí)，ADCC和CDC活性為低等級(jí)。此外，對(duì)于利用抗體Fab 端特異結(jié)合，阻斷內(nèi)皮/表皮生長(zhǎng)因子通路信號(hào)的機(jī)制，細(xì)胞增殖抑制活性應(yīng)為高等級(jí)，如貝伐珠單抗和曲妥珠單抗; 對(duì)于Fc 段介導(dǎo)的效應(yīng)細(xì)胞殺傷作用低的IgG2和IgG4，阻斷效應(yīng)功能應(yīng)為高等級(jí)，如抗PD-1抗體。同時(shí)，在《生物類似藥相似性評(píng)價(jià)和適應(yīng)證外推技術(shù)指導(dǎo)原則》中提出，生物類似藥的適應(yīng)證外推應(yīng)針對(duì)適應(yīng)證類型設(shè)計(jì)合適的生物學(xué)活性比對(duì)方案。

 

生物學(xué)活性與分子的翻譯后修飾?糖基化水平?高級(jí)結(jié)構(gòu)等質(zhì)量屬性密切相關(guān)，對(duì)以上屬性相似性有不確定性時(shí)，可以用生物學(xué)活性進(jìn)一步說(shuō)明和佐證。

 

2. 10 免疫學(xué)特性

 

抗體是獲得性免疫系統(tǒng)的關(guān)鍵組成部分，其相對(duì)保守的Fc段具有特定的免疫學(xué)特性。治療性抗體藥物的Fc段生物學(xué)功能包含對(duì)Fc受體結(jié)合能力及C1q結(jié)合能力的評(píng)價(jià)。

 

FcRn在體內(nèi)參與血清IgG的回收，影響血清半衰期，進(jìn)而影響藥效，相似性研究中，抗體的FcRn結(jié)合能力通常歸為中等級(jí)。

 

C1q是補(bǔ)體經(jīng)典激活途徑的第一個(gè)結(jié)合蛋白，與IgG的Fc段結(jié)合后能夠啟動(dòng)CDC效應(yīng); FcγRIIIa結(jié)合能力與高甘露糖化和去巖藻糖化修飾密切相關(guān)，從而影響抗體的ADCC 效應(yīng)，C1q和FcγRIIIa 結(jié)合能力在相似性評(píng)估中通常被定義為中等級(jí)。特定情況下，比如ADCC和CDC不是MoA，但C1q和FcγRIIIa 結(jié)合能力可以評(píng)估Fc段的糖鏈結(jié)構(gòu)以及抗體高級(jí)結(jié)構(gòu)完整性，所以也將其歸為中等級(jí)；FcγRIa，F(xiàn)cγRIIa(R)，F(xiàn)cγRIIa(H)，F(xiàn)cγRIIb/c和FcγRIIIb與糖型修飾關(guān)聯(lián)不如FcγRIIIa 緊密，通常歸為低等級(jí)。

 

值得注意的是，通常認(rèn)為抗體與FcγRIIIa 的結(jié)合能力和糖型中Man% 和Afuc% 的含量有關(guān)聯(lián)，但需要根據(jù)糖型的比例進(jìn)行綜合考量。如Amgen 公司的貝伐珠單抗生物類似藥中，雖然觀察到類似藥和原研藥中Man%和Afuc%的含量微小差異，但在FcγRIIIa結(jié)合能力的結(jié)果中顯示了高度相似性。因此，Man%和Afuc%微小差異不影響產(chǎn)品有效性。

 

2. 11 穩(wěn)定性研究

 

國(guó)內(nèi)外的生物類似藥指導(dǎo)原則中，均提到了對(duì)生物類似藥和參照藥進(jìn)行頭對(duì)頭的穩(wěn)定性研究，包括加速穩(wěn)定性和強(qiáng)制降解試驗(yàn)，以觀察生物類似藥和參照藥的降解趨勢(shì)和途徑的相似性評(píng)價(jià)。

 

根據(jù)《生物制品穩(wěn)定性研究技術(shù)指導(dǎo)原則(試行)》，對(duì)于4℃保存條件下的產(chǎn)品，加速穩(wěn)定性研究通常在25℃的條件下開(kāi)展，選擇的生物類似藥和參照藥的批次數(shù)及研究周期?檢項(xiàng)應(yīng)根據(jù)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和目的進(jìn)行選擇。最終可以觀察到生物類似藥和參照藥在加速條件下的穩(wěn)定性趨勢(shì)的相似性。強(qiáng)制降解研究中包含了高溫?光照?強(qiáng)酸?強(qiáng)堿?振搖?氧化和凍融等條件，在經(jīng)歷了這些條件后，通過(guò)監(jiān)測(cè)抗體一級(jí)結(jié)構(gòu)?純度和雜質(zhì)?電荷異質(zhì)性?生物學(xué)活性等變化趨勢(shì)，最終進(jìn)行相似性比對(duì)。值得注意的是，對(duì)于產(chǎn)品有效期，在歐洲EMA的指導(dǎo)原則中推薦采用生物類似藥自身穩(wěn)定性研究結(jié)果而定，不用和參照藥進(jìn)行效期比對(duì)。

 

3、結(jié)論和展望

 

質(zhì)量相似性是生物類似藥研究和開(kāi)發(fā)的前提，決定了工藝開(kāi)發(fā)的方向，為非臨床和臨床研究方案的設(shè)計(jì)提供參考。本文是基于多年來(lái)對(duì)生物類似藥的開(kāi)發(fā)和國(guó)際申報(bào)經(jīng)驗(yàn)，在總結(jié)國(guó)內(nèi)外最新生物類似藥法規(guī)基礎(chǔ)上，對(duì)抗體類生物類似藥的質(zhì)量相似性研究進(jìn)行了總結(jié)。系統(tǒng)介紹了質(zhì)量相似性研究的逐步遞進(jìn)原則和整體相似性原則，從參照藥、分析方法、相似性評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)以及研究關(guān)鍵點(diǎn)方面，全面介紹了生物類似藥的質(zhì)量相似性研究和評(píng)價(jià)，為抗體研發(fā)企業(yè)提供參考。國(guó)內(nèi)外生物類似藥的市場(chǎng)巨大，制藥企業(yè)的技術(shù)和平臺(tái)逐漸成熟，監(jiān)管體系也越來(lái)越完善，如何實(shí)現(xiàn)規(guī)范化、系統(tǒng)化引導(dǎo)，如原研藥質(zhì)量信息共享、相似性評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)的統(tǒng)一化、靶點(diǎn)和產(chǎn)能的優(yōu)化，形成數(shù)據(jù)共享和產(chǎn)能的宏觀引導(dǎo)，避免資源浪費(fèi)，是將來(lái)制藥企業(yè)和監(jiān)管機(jī)構(gòu)面臨的新挑戰(zhàn)和機(jī)會(huì)。

 

一點(diǎn)感想

 

從文中作者引用了大量Amgen的文獻(xiàn)可以看出，復(fù)宏漢霖的研究人員對(duì)于Amgen的仿制藥與原研藥的相似性評(píng)價(jià)進(jìn)行了深入的分析，并應(yīng)用于自己公司的仿制藥相似性評(píng)價(jià)。我自己在文獻(xiàn)調(diào)研的過(guò)程中也會(huì)發(fā)現(xiàn)大量的國(guó)外MNC公司發(fā)表的文章，比如各種稀奇古怪的案例等等。反觀國(guó)內(nèi)的藥企，缺乏的是對(duì)某些小而重要的問(wèn)題進(jìn)行深入研究的精神，也不是很注重藥物的質(zhì)量研究。當(dāng)然，隨著越來(lái)越多的藥企出海撈錢，與國(guó)外的質(zhì)量研究標(biāo)準(zhǔn)接軌是必然的，相信這會(huì)促進(jìn)國(guó)內(nèi)藥物質(zhì)量研究的發(fā)展。

 

參考文獻(xiàn)：

 

1.李思鵬,張仲理,許圣昌,張磊.單抗生物類似藥與原研藥質(zhì)量相似性研究解析[J].中國(guó)新藥雜志,2022,31(6):523-531.