原理

PCR 反應特異性擴增的一個關鍵條件是引物的正確設計，使用不合適的PCR 引物容易導致實驗失敗：表現為擴增出目的帶之外的多條帶（如形成引物二聚體帶），不出帶或出帶很弱，等等。
 

用途

合理的引物設計有利于得到特異性的產物

步驟

一、引物設計原則

1.引物長度：PCR 的特異性通過引物長度和退火溫度控制，一般16-24 個堿基。

注：引物長度（primer length）常用的是18-27 bp，但不應大于38，因為過長會導致其延伸溫度大于74℃，不適于Taq DNA 聚合酶進行反應。

2. G+C 含量：G+C 的含量一般控制在40-60% 左右。

注：GC 含量（composition）過高或過低都不利于引發反應。上下游引物的GC 含量不能相差太大。另外，上下游引物的Tm 值（melting temperature）是寡核苷酸的解鏈溫度，即在一定鹽濃度條件下，50% 寡核苷酸雙鏈解鏈的溫度。有效啟動溫度，一般高于Tm 值5~10℃。若按公式Tm= 4（G+C）+2（A+T） 估計引物的Tm 值，則有效引物的Tm 為55~80℃，其Tm 值最好接近72℃ 以使復性條件最佳。

3.堿基隨機分布。為避免PCR 產物的突變，一般不建議3' 端連續相同的堿基，并且目的片段的某一序列連續多個相同堿基的位置，極容易出現突變。

注：引物序列在模板內應當沒有相似性較高，尤其是 3' 端相似性較高的序列，否則容易導致錯誤引發（False priming）。降低引物與模板相似性的一種方法是，引物中四種堿基的分布最好是隨機的，不要有聚嘌呤或聚嘧啶的存在。尤其3′ 端不應超過3 個連續的G 或C，因這樣會使引物在GC 富集序列區錯誤引發。

二、實驗步驟

1.目的片段的獲取

設計引物取決于待擴增的目的片段。在NCBI 首頁的搜索框的下拉菜單中選擇Gene，再在對話框中輸入目的基因的名稱；選擇對應的來源之后，選擇對應需要的亞型，將其編碼基因的CDS 區域保存。

2.引物的設計

引物設計方法很多。用Oligo7 軟件打開保存的序列，將光標拉至擴增序列的最前端，點擊Edit，里面選擇Edit forward primer，系統默認21 個堿基，按照A/undefined2+C/undefined4 計算引物的Tm 值，一般Tm 值在54-64 之間，可根據這個范圍調節引物的長度。調整完成之后將這段編輯后的序列按5'-3' 的方向復制到Excel 表格中，同樣的方法設計后引物并復制到Excel 表格。

3.引物的調整

按照質粒構建的方法，在前后引物的5' 端加上酶切序列（T4 連接酶的方法）或15-20 bp 的載體酶切位點附近的載體序列（同源重組的方法），按照載體上的酶切序列編碼情況，還需要在前引物ATG 起始前加入堿基以免編碼錯位，以及確認后引物是否需要終止密碼子。

注意事項

1.注意正反向引物都是5'-3' 的方向；

2.注意前引物中可能存在錯碼的可能以及后引物的提前終止。

常見問題

一、PCR 沒有產物或二聚體太多

1.引物設計錯誤，特別是沒有注意后引物的方向；

2.調節PCR 時退火溫度

3.提高模板的質量或模板的使用量；

4.設計新的引物。

二、構建的質粒不能編碼基因

1.沒有注意前引物的移碼突變問題；

2.沒有注意后引物終止密碼子的問題；

3.排除其他情況下，換載體。